质粒(pDNA)生产

质粒DNA (pDNA)

质粒DNA(pDNA)是许多基因工程研究的重要起点,包括重组蛋白、病毒载体和高级生物治疗药物的研发。基因治疗及基于 DNA/RNA的疗法 的持续推进,导致对适用于临床应用的可靠的pDNA生产工艺的需求也在不断增加。

质粒是自然存在于细菌中的环状DNA分子。它们可从细菌基因组DNA中独立复制(游离型),这一特性使其非常适合作为基因工程的载体。纯化后的pDNA可用作一些生产工艺的原料,例如生产腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体、 mRNA 生产过程中的体外转录(IVT)反应及直接基因转移等。

赛多利斯提供各种生产工具,助力实现pDNA的高效生产。探索从细菌到最终过滤的质粒DNA生产过程,并发现能协助您完成每一步骤操作的解决方案。

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挑战

由于pDNA的尺寸、剪切敏感性及其与某些污染物的相似性,要回收高产量的pDNA非常难实现。

  • 高密度细胞培养通常很难监控、维护及收获。
  • 剪切力可破坏pDNA并降解沉淀的基因组DNA,从而污染质粒提取物。
  • 大质粒(>6kb)很难用树脂等传统方法纯化,因为它们无法通过孔隙扩散。
  • 从污染物(包括不需要的质粒异构体)中分离pDNA以获得同质产物有很高的技术要求,通常需要执行多个层析纯化步骤。
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pDNA生产工艺

分离质粒DNA所需的典型步骤

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CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™

两步式pDNA纯化平台

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pDNA生产工艺

从大肠杆菌到纯化的质粒

将目标基因插入pDNA中,然后通过电穿孔在一个被称为转化的工艺步骤中将其导入宿主细菌(通常是大肠杆菌)。宿主细胞在发酵过程中进行复制,复制质粒并以高产率得到所需的序列。在细胞达到所需的密度后,即可以收获细胞,然后提取pDNA(此步骤通常通过碱裂解来完成)。然后澄清裂解物,并使用层析法纯化pDNA。最后,对质粒进行浓缩和过滤,再执行质量控制措施,以确保产物具有足够的纯度。

扩增宿主细菌,以产生数百万个pDNA复制体

质粒生产中上游工艺的目的是利用宿主细胞群生产尽可能多的pDNA。通常使用大肠杆菌作为宿主细胞,因为它们能够快速增殖并产生高产量的pDNA。选择高产的克隆并进行种子培养,从而提供足够的细胞数量来接种到生产用生物反应器中。培养结束后,通常通过离心法收获细胞。

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您的需求:

一个可放大的生产平台,简单且可靠的实现细胞生长优化并尽可能提高质粒的产量

  • 稳健、可控且高效的生产
  • 无菌种子培养,避免交叉污染
  • 高速补料泵 
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我们独有的解决方案:

赛多利斯提供适用于各种生产规模的微生物发酵解决方案。 

Biostat® D-DCU是一款紧凑型生物工艺系统,容器大小为10至200 L,可满足大肠杆菌的高密度发酵(>50OD)需求。

  • 整个工艺采用一种独特且坚固的膜,用于优化细胞生长条件 
  • 集成各种工艺分析技术(PAT),包括 BioPAT TraceBioPAT Fundalux 
  • Ambr®到搅拌式反应器(STR),灵活性高并可充分缩放,可以快速进行工艺开发

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  • Mycap CCX – 一种细胞培养扩增系统,让您无需打开培养瓶或进入生物安全柜即可培养和传代细胞
  • Ambr® 250一次性多平行生物反应器,可适用于微生物发酵以加速工艺开发。
  • 我们 Green Line 中的一次性中空纤维筒支持从高密度培养物中收获细胞。

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裂解宿主细胞,以释放pDNA

细胞裂解的目的是释放pDNA并去除细胞碎片和基因组DNA。收获宿主细胞后,即可用NaOH溶液溶解细胞团块,然后再用乙酸钾中和。由此产生的沉淀物含有杂质,其中包括宿主细胞蛋白质和DNA。

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从pDNA中初步去除细胞碎片

从碱裂解步骤收集的物质中含有pDNA以及宿主细胞的污染物。澄清步骤可以在高密度细胞培养物中提纯pDNA,去除细胞碎片和杂质。

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您面临的挑战

能够将杂质从高密度细胞裂解物中分离出来的最佳pDNA澄清解决方案

  • 能够处理高粘度溶液的工具
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我们独有的解决方案:

赛多利斯提供各种切向流过滤(TFF)耗材,适用于从工艺开发到大规模商业生产的多种应用。我们的Green系列中空纤维模块是完全可放大的平台,用于澄清细胞裂解物,尤其是在高细胞密度环境中澄清。建议Hydrosart® 0.2µm微滤膜用于中等或较低细胞浓度的澄清。

  • 该膜的截留分子量为3 kD至750 kD,孔径为0.1μm至0.65μm
  • 伽马辐照;一次性即用型产品,可节省设备组装时间和成本
  • 对高细胞密度培养物中的粘性裂解物特别有效

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  • Sartopore® 2系列提供了范围最广的PES膜产品组合,能够以最低的过滤成本完美地适应所有产品类型。
  • 赛多利斯提供各种TFF系统,适用于从工艺开发到大规模商业生产的应用。我们的解决方案可以选择使用一次性且经伽马辐照的流体管理组件来实现功能性的密闭处理。

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样品体积缩小,并从缓冲液中去除小分子。

浓缩pDNA、去除污染物及缓冲液更换等步骤在pDNA生产中至关重要,但是由于pDNA尺寸大和剪切敏感性,导致在执行这些步骤时可能会遇到困难。最新的创新技术结合了低剪切操作和全密闭处理,可在密闭系统中获得最高的回收率,并能为pDNA生产创造理想的环境。

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您面临的挑战:

为大尺寸敏感型分子量身打造的浓缩解决方案

  • 剪切受限,可最大限度地减少降解并提高回收率
  • 最大限度的提高大尺寸结构的回收率
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我们独有的解决方案:

赛多利斯提供适用于生物分子浓缩/渗滤的强大产品组合。我们的Green系列中空纤维一次性流量组件代表一个可浓缩pDNA的完全可扩展系统

  • 拥有一系列的尺寸,支持大质粒过滤(高达750 kb)。  研究建议在30 kD至750 kD MWCO之间。
  • 经伽马辐照并可随时使用,缩短操作时间
  • 低剪切操作

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  • The Sartopore® 2 family includes the broadest range of PES membrane combinations that perfectly adapt to all types of products for the lowest filtration costs


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质粒DNA的分离

作为一种生物制药产品,pDNA的纯度、功效和产量都有严格的要求。pDNA捕获是下游工艺中的关键步骤,可在浓缩pDNA的同时去除大部分污染物。

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您的需求:

灵敏、低剪切的pDNA捕获工艺适用于大分子。

  • 高效、温和地去除杂质,避免降解
  • 采集方法无尺寸限制
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我们独有的解决方案:

HIP² Plasmid Process Pack™是由赛多利斯的资深科学家开发的用于pDNA纯化的端到端解决方案。

CIMmultus® DEAE 色谱柱代表我们向有效净化pDNA的即插即用平台迈出的第一步

  • 浓缩pDNA并去除大部分宿主细胞蛋白及其他核酸
  • pDNA的高动态结合能力
  • 低剪切力可最大限度提高pDNA回收率
  • 我们的详细、明确的方案支持开发稳健的工艺

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  • Allegro一次性层析系统旨在用于试验、临床及商业生产。灵活的模块化设计为层析柱和膜操作提供等浓度或梯度设置选项

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分离质粒异构体,以产生均一的pDNA

分离pDNA异构体需要额外的精纯层析步骤,通常用于从开环(OC)和线性DNA中分离超螺旋(SC)pDNA。制药pDNA对纯度、均一性和功效都有严格要求,而SC-pDNA是最稳定、高效并具有生物活性的结构形式

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您的需求:

高效、稳健的精纯层析解决方案,能可靠地产生均一的pDNA提取物

  • 该方法必须具有足够的灵敏度,才能分离出质粒异构体
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我们独有的解决方案:

赛多利斯的HIP² Plasmid Process Pack™ 是一个综合型pDNA纯化解决方案。
CIMmultus® C4 HLD 层析柱是HIP² Plasmid Process Pack™ 的第二步。

  • 从超螺旋(SC)pDNA中分离开环(OC)和线性pDNA异构体
  • 动态结合能力高,剪切低,可最大限度提高pDNA回收率
  • 灵活性高,可扩展性

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  • Allegro一次性层析系统旨在用于试验、临床及商业生产。灵活的模块化设计为层析柱和膜操作提供等浓度或梯度设置选项

样品体积缩小,并从缓冲液中去除小分子。

浓缩pDNA、去除污染物及缓冲液更换等步骤在pDNA生产中至关重要,但是由于pDNA尺寸大和剪切敏感性,导致在执行这些步骤时可能会遇到困难。最新的创新技术结合了低剪切操作和全密闭处理,可在密闭系统中获得最高的回收率,并能为pDNA生产创造理想的环境。

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您面临的挑战:

为大尺寸敏感型分子量身打造的浓缩解决方案

  • 剪切受限,可最大限度地减少降解并提高回收率
  • 最大限度的提高大尺寸结构的回收率
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我们独有的解决方案:

赛多利斯提供适用于生物分子浓缩/渗滤的强大产品组合。我们的Green系列中空纤维一次性流量组件代表一个可浓缩pDNA的完全可扩展系统

  • 拥有一系列的尺寸,支持大质粒过滤(高达750 kb)。  研究建议在30 kD至750 kD MWCO之间。
  • 经伽马辐照并可随时使用,缩短操作时间
  • 低剪切操作

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  • The Sartopore® 2 family includes the broadest range of PES membrane combinations that perfectly adapt to all types of products for the lowest filtration costs


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对分离的pDNA进行除菌过滤,以防止出现微生物污染

最终除菌过滤步骤对于防止微生物污染和确保患者安全至关重要。这种创新的风险缓解策略可保证从最后一个过滤步骤到一次性袋储存的整个操作的完整性。

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您的需求:

适用于剪切敏感型大pDNA分子的除菌过滤解决方案

  • 适用于粘性溶液
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我们独有的解决方案:

赛多利斯可为您的应用提供最先进的除菌过滤器。Sartopore® 2 系列包含了范围最广的PES膜组合,能够以最低的过滤成本完美地适应所有产品类型。

  • 最终膜孔径为0.2或0.45µm
  • 集成在过滤转移装置中,可实现封闭的一次性应用

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  • Sartopore® Platinum是最终灌装应用的理想选择。PES膜独特的改性表面可吸附性最低,产品收率高,有助于为可靠的完整性测试安全地进行润湿
  • Sartocheck 5 是除菌级过滤器完整性检测的基准。该设备旨在通过最高的量化风险管理(QRM)测试标准提供直观、领先的数据安全性和完整性 

必须在整个pDNA纯化过程中进行分析,以确定是否存在杂质并对产品进行定量检测。提供的信息可为工艺控制、稳健性和高产品质量提供支持。

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您面临的挑战

可对pDNA样品进行综合评价的分析解决方案 

  • 快速提供最终产品的全貌
  • 避免采用劳动密集型方法 
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我们独有的解决方案:

赛多利斯提供用于监控pDNA样品的完整解决方案。

我们的CIMac™ pDNA 0.3 mL 分析用层析柱 旨在对质粒DNA进行快速且可重复的HPLC监测和定量,也可用于分离不同的质粒DNA异构体。

  • 主要设计用于在纯化工艺中各阶段对pDNA样品进行过程中和最终控制,
  • 也可用于确定是否存在RNA和内毒素
  • 快速的高精度分析 
  • 分离不受流量影响
  • 高灵敏度和重现性
  • The PATfix™ HPLC系统为您提供“在线”分析,可使用HPLC指纹图谱控制杂质和关键质量组分

CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™

CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™ 

我们推出的即用型pDNA纯化包旨在帮助科学家开发自己的pDNA纯化工艺并将其转移到生产中。HiP2平台只需两个层析步骤(先是阴离子交换层析,然后是疏水层析),即可有效回收pDNA。 

  • 高效 - 去除大部分污染物(RNA、基因组DNA、宿主细胞蛋白质和内毒素)并分离超螺旋pDNA
  • 快速 - 该艺只需几个小时即可完成,不仅能提高生产率,并能将生产成本降至最低。明确实验方案有助于快速开发出稳健的纯化工艺。
  • 可放大 - 整体柱的独特性能有助于在各个生产规模之间的无缝转移,从小规模实验室到大规模pDNA工业纯化。 

提高pDNA下游工艺的生产率

了解更多关于在pDNA纯化过程中如何使用整体柱进行精纯层析的信息

下载应用说明

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纯度

完美去除所有杂质(包括异构体分离),可得到高纯度且均一的pDNA样品

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生产率

在不影响回收和性能的情况下快速进行处理,尤其是处理大尺寸质粒时

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即插即用

工具箱包含两个随时可用的层析柱以及详细的方案,便于快速将其整合到您的工艺中

CIMmultus® HiP2 Plasmid Process Pack™中的产品

CIMmultus® DEAE

阴离子交换层析

使用弱阴离子交换层析,CIMmultus®二乙胺(DEAE)可浓缩pDNA并去除大部分污染的宿主细胞蛋白质、mRNA和基因组DNA。

  • 在两步骤质粒工艺包中进行初步捕获

  • 可用于处理其他纯化方法所得的净化后的裂解物或部分纯化的质粒

  • pDNA分子高载量,都集中在单峰中

  • 不与大多数杂质结合(RNA除外,它在第一次增加NaCl后洗脱)

  • 不受pDNA尺寸因素的限制

    • 对于大于11Kb的pDNA,我们建议使用6μm孔径的层析柱

工作原理

CIMmultus® DEAE的pDNA提取物的色谱图。pDNA可以有效地从RNA和其他污染物中分离出来。

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CIMmultus® C4 HLD

疏水层析法

CIMmultus® C4高配体密度(HLD)丁基修饰整体柱消除了清除的基因组DNA、内毒素和开环(OC)和线性pDNA异构体,从而分离出超螺旋(SC)pDNA。

  • 在两步质粒工艺包中执行精纯步骤

  • 高盐浓度下有助于pDNA的结合

  • 剩余的非DNA污染物被清除

  • 有助于超螺旋pDNA与其他异构体的分离

  • pDNA纯化可在结合洗脱或者样品置换模式下进行

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工作原理

CIMmultus® C4 HLD捕获pDNA色谱图。去除剩余的污染物,高效分离SC-pDNA与OC-pDNA。

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mRNA工具箱

了解 mRNA 分子是如何制造的,以及我们的工具如何帮助您优化每一步的流程。

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资源

应用说明:对基于CIMac™pDNA分析型层析柱的pDNA生产进行工艺过程中控制

PDF | 463.7 KB

应用说明:用于pDNA样品置换层析的HIC整体支持的比较

PDF | 468.2 KB

应用说明:使用CIMmultus® C4 HLD 整体柱回收丙型肝炎疫苗的pDIKE2质粒

PDF | 338.5 KB

海报:体外线性质粒DNA的制备...

PDF | 554.1 KB

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