什么是细胞凋亡？
细胞凋亡是正常组织发育和内稳态的重要过程，细胞通过该过程适时发生程序性细胞死亡。细胞凋亡信号传递的异常与各种人体病症有关，包括癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病。在大多数情况下，细胞凋亡诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 (Caspase) 激活和质膜改变。Caspase-3 或 Caspase-7 的激活导致细胞不可逆地发生凋亡，被视为可靠的细胞凋亡标志物。质膜磷脂酰丝氨酸 (PS) 对称性的调节性损失也是典型的细胞凋亡标志物。濒死细胞触发细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸 (Phosphatidylserine, PS) 外翻到细胞表面，从而允许周围的吞噬细胞对濒死细胞进行早期吞噬识别。
研究人员已经设计了许多酶促分析、酶标仪和流式细胞仪来测定 Caspase-3/7 激活或磷脂酰丝氨酸外翻。大多数 Caspase-3/7 分析涉及荧光素酶、比色或荧光试剂底物，这些底物包含由酶识别的 DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) 肽基序。Annexin V 是一种重组蛋白，对 PS 残基具有高亲和力和选择性，可用于检测细胞凋亡。使用 Annexin V 偶联荧光探针进行的细胞凋亡分析已针对 PS 外翻检测进行了优化，并且最常通过流式细胞术进行测定。这些常用的细胞凋亡分析法的主要缺点在于：(1) 它们产生单一、（任意）用户自定义的终点测量值；(2) 它们需要多个洗涤步骤或细胞分离，可能导致凋亡细胞的损失或导致 PS 不对称性的损失；(3) 由于信号背景随时间推移而不断增加，因此不适合进行长期测量。
应用
Incucyte® 细胞凋亡分析方案简介
Incucyte® 活细胞分析系统能够在您的组织培养箱内进行实时、自动化细胞凋亡分析。使用即混即读的 Incucyte® Caspase-3/7 和 Annexin V 染料同时实时检测多种细胞凋亡途径。将细胞凋亡信号与 Incucyte® 高清相差图像相关联，为凋亡细胞死亡提供额外的生物学信息和形态验证（例如细胞皱缩、质膜出泡、细胞核固缩）。
- Incucyte® Caspase-3/7 染料为惰性、非荧光 (DEVD) 的底物，可自由穿过细胞膜，它们可被激活的 Caspase-3/7 裂解，释放出绿色或红色可结合 DNA 的荧光标记。通过荧光标记的细胞核的出现来识别凋亡细胞。
- Incucyte® Annexin V 染料标记有异常明亮且具有光稳定性的 CF 染料，在与凋亡细胞中暴露的 PS 结合后，发出绿色、红色、橙色或近红外荧光信号。
使用 Incucyte® 细胞凋亡分析法检测肿瘤、免疫或神经元培养物中的细胞凋亡。实时检测经 TNFα 和放线菌酮处理的 Incucyte® Nuclight 绿色标记的 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞（左侧视频）经喜树碱处理的 Jurkat T 淋巴细胞（右侧视频）中的细胞凋亡。分别使用即混即读的 Incucyte® Caspase-3/7 红色染料或 Annexin V 红色染料将凋亡细胞标记为红色。使用 Incucyte® 活细胞分析系统对凋亡细胞进行实时定量。
Incucyte® 细胞凋亡检测原理
- 通过将即混即读的 Incucyte® Caspase-3/7 和 Annexin V 染料加入培养物中，实时检测细胞凋亡
- 使用直观的 Incucyte® 图像分析工具自动定量凋亡细胞
- 通过将 Incucyte® Nuclight 核标记试剂或 Incucyte® Cytotox 染料相结合，获得多重细胞凋亡读数与增殖或细胞毒性测定结果
关键优势
Incucyte® 细胞凋亡分析方案的关键优势
- 使用延时成像实现细胞凋亡的可视化和定量 -观察随时间推移的细胞凋亡并使用直观的 Incucyte® 图像分析工具对细胞凋亡进行定量。利用图像和视频显示形态变化并验证治疗效果。
- 在培养箱内自动分析细胞凋亡的时程- 确定处理效果如何以及何时发生作用，无需将细胞从培养箱的稳定环境中取出 - 非常适合长期研究（0 至 10 天以上）。
- 简单的即混即读 96/384 孔板方案，无需细胞清洗、固定和分离操作 - 接种细胞，并将处理试剂与 Incucyte® Caspase-3/7 或 Incucyte® Annexin V 染料一起加入，在 Incucyte® 活细胞分析系统中进行动态读数。系统每次可读取多达 6 × 384 孔板，可用于中/高通量的筛选。
- 通过两种不同的途径检测和确认细胞凋亡 - 多重 Incucyte® Caspase-3/7 和 Annexin V 染料，以验证细胞凋亡机制。
- 包含增殖和细胞毒性测定的多重分析- 将 Incucyte® 细胞凋亡分析与 Nuclight 试剂或 Cytotox 染料相结合，进行增殖/细胞毒性的多重测定。可方便地区分细胞抑制性作用和细胞毒性处理作用。
使用延时成像实现细胞凋亡的可视化和定量
图 1. 使用 Incucyte® 细胞凋亡分析和图像分析工具对选定细胞中的细胞凋亡进行定量。（顶部最左侧图）在喜树碱 (100 µM) 和 Incucyte® Caspase-3/7 绿色染料存在下，HT-1080 肉瘤细胞的 Incucyte® 图像。请注意伴随 Caspase-3/7 绿色荧光信号的特征性细胞出现皱缩和质膜出泡。（底部最左侧图）Incucyte® 图像分析工具能够对凋亡肿瘤细胞（粉色 mask）进行自动计数。（顶部中间偏左侧图）在 Caspase-3/7 红色染料存在下，经 TNFα 和放线菌酮处理的 MDA-MB-231 乳腺癌细胞的 Incucyte® 图像。（底部中间偏左侧图）Incucyte® 图像分析工具能够对凋亡肿瘤细胞（浅蓝色 mask）进行自动计数。（顶部中间偏右侧图）在喜树碱 (1 µM) 和 Incucyte® Annexin V 红色染料存在下，Jurkat T 淋巴细胞的 Incucyte® 图像。（底部中间偏右侧图）自动图像分析（蓝色 mask）能够直接检测凋亡免疫细胞。（右上图）在谷氨酸 (300 µM) 和 Incucyte® Annexin V 绿色染料存在下，与星形胶质细胞共培养的原代大鼠前脑神经元的 Incucyte® 图像。将神经元用 Incucyte® Neurolight 红色慢病毒进行选择性标记。（右下图）所分析的图像（蓝色 mask）阳性标记出凋亡细胞。
在培养箱内自动分析细胞凋亡的时程
图 2. 自动、非侵入性地定量处理效果。Incucyte® 细胞凋亡分析方案能够对 96/384 孔板中的每个孔进行自动成像和分析，提供随时间变化的细胞毒性的微孔板读数（左图）。时间进程图显示处理效果呈浓度依赖性（中间图）。将数据转化为浓度响应曲线，比较药理学结果（右图）。
简单的即混即读 96/384 孔板方案 - 无需细胞清洗、固定和分离操作
接种细胞，并将处理试剂与 Incucyte® Caspase-3/7 或 Incucyte® Annexin V 染料一起加入，在 Incucyte® 活细胞分析系统中进行动态读数。系统每次可读取多达 6 × 384 孔板，可用于中/高通量的筛选
通过两种不同的途径检测和确认细胞凋亡
图 4. 通过两个细胞凋亡读数确认凋亡细胞死亡。同时检测培养物中的 Caspase-3/7 和 Annexin V 信号。自动确定凋亡细胞死亡的时程。
包含增殖和细胞毒性测定的多重分析
图 5. 利用活细胞无标记计数以及细胞毒性和增殖的时程和浓度依赖性定量进行细胞凋亡的多重分析。在含有 Incucyte® Annexin V 绿色染料的情况下，使用喜树碱 (1 µM) 或环己酰亚胺 (1 µM) 处理 HT-1080 纤维肉瘤细胞，以检测 24 小时的凋亡细胞（图中显示死亡细胞 mask）。用于鉴别绿色（凋亡）细胞群的分类图（第二列）、时程图（第三列）和浓度响应曲线（第四列）显示了细胞毒性化合物与细胞抑制化合物的效果差异。
常见问题解答
是的，原则上是这样。使用一系列贴壁和非贴壁细胞系对 Caspase-3/7 和 Annexin V 方案进行了优化，因此应当适用于所有细胞类型（包括癌细胞、免疫细胞和神经元）。请注意，某些细胞类型可能缺乏 Caspase-3 的表达（例如 MCF-7 细胞）。对于这些细胞类型，我们建议使用 Incucyte® Annexin V 试剂代替 Caspase-3/7 试剂进行细胞凋亡检测。
可以。此处所述的方案和数据表明，可以对悬浮细胞系（例如 Jurkat 人 T 淋巴细胞）中的细胞凋亡进行定量。您可能需要包被样品板以确保悬浮细胞保持在视野内。已证明，多聚-L-鸟氨酸、多聚-D-赖氨酸或 Matrigel™ 等包被剂效果良好。
可以。只要荧光团与 Incucyte® 活细胞分析系统兼容并且不干扰所用 Incucyte® Caspase 3/7 或 Annexin V 试剂发出的荧光即可。
可以。此处所述的方案和数据表明，可以定量分析单个孔中的两种细胞凋亡标志物（例如半胱天冬酶-3/7 激活和磷脂酰丝氨酸外翻）。为此，我们建议将 Incucyte® Annexin V 红色染料（产品目录号 4641）与绿色 Incucyte® Caspase-3/7 试剂（产品目录号 4440）结合使用。
可以。将 Incucyte® Caspase-3/7 试剂（产品目录号 4440）与 Incucyte® 红色 Cytotox 试剂（产品目录号 4633）联用或将相对的红色和绿色版本的 Incucyte® Annexin V 试剂（产品目录号 4641 或 4642）和 Incucyte® Cytotox 试剂（产品目录号 4632 或 4633）联用。
可以。可以将 Incucyte® Annexin V 红色染料（产品目录号 4641）与碘化丙啶联用。我们建议使用 Incucyte® 系统的红色通道定量碘化丙啶信号，并将红色与绿色的光谱分离参数设置为 80%（更多信息参见《荧光染料优化技术指南》）。***
已同时使用 10 倍和 20 倍物镜生成了数据。10 倍物镜的优势在于视野更大，并减少了每孔所需的图像数量。为获得更高的空间分辨率，建议使用 20 倍物镜。
Incucyte® 细胞凋亡分析方案可使用 Incucyte® ZOOM 系统支持的任何透明面或黑面 96 孔或 384 孔透明底微孔板。此处所述的实验采用 Corning 96 孔板（产品目录号 3904）。
不需要。Incucyte® Annexin V 试剂专为使用 Incucyte® 系统进行活细胞成像而配制。即混即读方案操作简单。无需洗涤或固定。
可以。将 Incucyte® Annexin V 或 Caspase-3/7 试剂与 Incucyte® 系统配合使用时，无需使用专门的分析培养基或缓冲液。集成式 Incucyte® 图像分析工具使您能够最大程度地减小可能由所使用的培养基、试剂或检测试剂引起的任何背景荧光。但是请注意，Annexin V 与外翻的磷脂酰丝氨酸的结合具有 Ca2+ 依赖性，因此需要确保分析培养基的 Ca2+ 浓度 ≥ 1 mM。
我们建议在使用 Incucyte® Caspase 3/7 细胞凋亡试剂时对凋亡细胞进行计数。Caspase-3/7 试剂标记凋亡细胞的细胞核，因此很容易区分相邻凋亡细胞的离散标记的细胞核。而 Incucyte® Annexin V 试剂会标记整个细胞表面。因此，区分相邻细胞可能具有挑战性。我们建议使用 Annexin V 试剂对总荧光面积进行定量，因为这是一种更稳定的方法。
是的，细胞凋亡的检测结果可归一化至 Incucyte® 无标记细胞汇合度测定结果。尽管某些治疗可能会导致显著的细胞破碎或细胞相位差变化，但我们发现 Incucyte® 相位差汇合度指标可为测定过程中的总细胞数提供信息丰富的估计值。
也可以在细胞凋亡测定结束时归一化至包含对象的 DNA 总数。为此，我们建议使用 Vybrant® DyeCycle™ 绿色染色剂 (ThermoFisher)。该染色剂可直接加入测定孔中，无需吸入含有细胞凋亡试剂的培养基或用其洗涤。
订购信息
订购信息
Incucyte® Caspase 3/7 和 Annexin V 染料经过充分验证，可与 Incucyte® 活细胞分析系统配合使用。此外，它们可以与我们的 Incucyte® Nuclight 核标记试剂系列或 Incucyte® Cytotox 染料联合使用，用于对同一孔内的增殖和细胞毒性以及细胞凋亡进行多重测定。
产品 | 数量 | 产品目录号 |
|---|---|---|
| 用于细胞凋亡分析的 Incucyte® Caspase-3/7 绿色染料 | 1 瓶：20 μL（100-200 次检测） | 4440 |
| 用于细胞凋亡分析的 Incucyte® Caspase-3/7 红色染料 | 1 瓶：20 μL（100-200 次检测） | 4704 |
| 用于代谢检测的 Incucyte® Caspase-3/7 染料 | 1 瓶：20 μL（100-200 次检测） | 4776 |
| Incucyte® Annexin V 绿色染料 | 1 瓶：100-200 次检测 | 4642 |
| Incucyte® Annexin V 红色染料 | 1 瓶：100-200 次检测 | 4641 |
Incucyte® Annexin V 橙色染料 | 1 瓶：100-200 次检测 | 4759 |
Incucyte® Annexin V NIR 染料 | 1 瓶：100-200 次检测 | 4768 |
Incucyte® MMP 橙色试剂盒 | 1 盒： MMP 橙色试剂：30 µL（200 次检测） FCCP：10 µL（16 次检测） 寡霉素：10 µL（16 次检测） | 4775 |
Incucyte® Cytotox 绿色染料 | 5 瓶：5 μL（100 次检测） | 4633 |
Incucyte® Cytotox 红色染料 | 5 瓶：5 μL（100 次检测） | 4632 |
Incucyte® Cytotox NIR 染料 | 1 瓶：100 μL（500-1000 次检测） | 4846 |
