用于活细胞分析的 Incucyte^® Akt 激酶检测

Akt 激酶检测概述

激酶信号在耦合外部刺激以改变下游生理功能（例如健康细胞代谢、增殖和存活）的过程中具有至关重要的意义。信号转导通路失调与癌症的发生、发展和复发相关。Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在多种癌症类型中其表达均有所上调，该激酶与细胞的异常生长、凋亡和代谢具有机制相关性，因此它已在广泛研究中被用作肿瘤治疗的靶点。

Akt 信号转导网络抑制剂已显示出作为单药治疗的临床前景，或可与常规化疗药物联用以提高癌症的治疗效果。由于测定激酶活性标准方法的局限性，识别上述抑制剂颇具挑战。研究激酶活性的动态变化尤为困难，且缺少在相关生理环境中测定活细胞变化的分析方法。

使用传统方法研究激酶活性较为困难，原因如下：

过程繁琐，需手动进行样品制备
终点分析测量局限于单个时间点
无法监测同一细胞的多次处理效果
由于通量有限，待研究的样本数受限

借助 Incucyte^® Akt 激酶检测，研究人员可在生理相关环境下测定和分析活细胞中 Akt 活性的动态变化，并结合蛋白激酶活性的长期评估和对细胞增殖的影响，进一步深入了解处理效果。

应用

Incucyte^® Akt 激酶绿色/红色慢病毒试剂可高效、无干扰且均匀地标记哺乳动物细胞，用于 Akt 激酶活性动态变化的体外分析。这种慢病毒试剂是一种基因编码传感器，基于绿色荧光蛋白标记的 Akt 底物，底物的亚细胞定位呈磷酸化依赖性，由红色荧光蛋白标记的核标记物指示核/细胞质边界。

底物被 Akt 磷酸化后，绿色荧光传感器将从细胞核转移到细胞质。抑制 Akt 可阻止传感器磷酸化，使传感器保留在细胞核内。本分析方案提供了一种有效的解决方案，可在生理相关环境下测定和分析活细胞中 Akt 活性的动态变化。

关键优势

新型无干扰试剂– Incucyte^® Akt 激酶慢病毒试剂可在多种细胞类型中表达稳定的基因编码的激酶活性报告物
提高分析效率 - 缩小单一靶向生化检测和后续低通量细胞实验的差距，确定新型治疗方法
Akt活性的时效研究- 通过灵活检测活细胞中 Akt 活性随时间的动态变化，开启研究新视角
同时进行细胞计数- 在同一实验中进行 Akt 激酶活性定量和增殖分析

新型无干扰试剂

Incucyte^® Akt 激酶慢病毒试剂可在多种细胞类型中表达稳定的基因编码的激酶活性报告物，从而监测活细胞中 Akt 激酶活性随时间的变化。

图 1.测量化合物对活细胞中 Akt 活性的影响。使用 Akt 选择性抑制剂 MK2206 处理可稳定表达 Incucyte^® Akt 激酶绿色/红色指示剂的 SK-OV-3 细胞，使绿色荧光传感器从细胞质转移到细胞核。如左侧的动力学图表所示，核转位比率随时间推移而下降，表明 Akt 具有抑制作用。顶部的图中显示了相位和红色荧光图像通道，底部的图中显示了绿色荧光通道。可以看到，绿色荧光传感器在 28 分钟内从细胞质转移到细胞核中，而红色荧光核标记物的位置没有变化。

提高分析效率

通过在 96 孔板中评估多种化合物或处理方法提高分析效率，可缩小单一靶向生化检测和后续低通量细胞实验的差距，确定新型治疗方法。

图 2.在单个 96 孔板中，使用活细胞动力学数据评估多种化合物 Akt 活性的时间依赖性效应。 将稳定表达 Incucyte^® Akt 激酶绿色/红色指示剂的 A549 细胞以 5000 个细胞/孔的密度接种到 96 孔板中。使用靶向 PI3K/Akt 激酶通路的抑制剂处理细胞，包括变构 Akt 抑制剂 MK2206 和 API-1、Akt 竞争性抑制剂 AZD5363 和 Ipatasertib，以及上游 PI3K 激酶抑制剂 LY294002 和 PI-103。如 96 孔板视图（左）所示，在所有测定的化合物中，核转位比率 (NTR) 呈时间和浓度依赖性下降，表明 Akt 具有抑制作用。AZD5363 和 LY294002 24 小时的 NTR 动力学图表（中间图）显示了不同的动力学曲线。添加 AZD5363 会在 24 小时内对 Akt 产生持续抑制，而添加 PI3K 抑制剂 LY294002 会导致 NTR 的短暂下降，然后恢复至基线，表明 Akt 重新激活。 IC50 曲线（右图）显示在时间点 1.5 h 和 25 h 的数据。

Akt 活性的长期研究

通过活细胞中 Akt 活性的短期和长期动态变化的持续、灵活检测，开启研究新视角。自动测定并直观显示 Akt 的抑制作用，可获得任何时间点的动力学数据。

图 3.观察血清饥饿和 Akt 激活的影响随时间的变化。将可稳定表达 Incucyte^® Akt 激酶绿色/红色指示剂的 HeLa 细胞转移到不含血清的培养基中，清除已知的可激活 PI3K/Akt 激酶通路的各种生长因子。血清转移导致核转位比率 (NTR) 降低，提示 Akt 活性下降，但在保存于 10% 血清中的对照孔中没有观察到变化。 4 小时后，用 1.1 ng/mL 表皮生长因子 (EGF) 或 3.3 nM R3-IGF-1（一种胰岛素样生长因子的重组类似物）处理细胞。 NTR 的快速增长表明 Akt 被两种化合物诱导激活。 R3-IGF-1 加入后，可在 12 小时内持续激活 Akt，而 EGF 的激活作用随时间而减弱。图中显示了所有条件下生成的代表性图像。加入化合物前，传感器位于不含血清的培养基中的细胞核和 10% 血清中对照细胞的细胞质中 (3 h)。 EGF 或 R3-IGF-1 激活 Akt 后，传感器会从细胞核转移到细胞质 (4.5 h)。在 EGF 处理的细胞中，Akt 的活性随时间降低，传感器回到细胞核，但在 R3-IGF-1 处理的细胞中，传感器仍在细胞质中 (12 h)。

同时进行细胞计数

在同一实验中进行 Akt 激酶活性定量和增殖分析。在同一细胞群中研究 Akt 的抑制作用对癌细胞增殖的影响。

图 4.在同一实验中同时进行 Akt 活性测定和细胞增殖分析。将表达 Incucyte^® Akt 激酶绿色/红色指示剂的 MDA-MB-231 和 T-47D 细胞分别以 2500 和 4000 个细胞/孔的密度接种到 96 孔板中。使用选择性 Akt 抑制剂 (MK2206) 和蛋白质合成抑制剂（环己酰亚胺）处理细胞后，可在同一细胞中同时监测核转位比率 (NTR)，用于测量 Akt 活性，以及红色荧光计数 (Red Object Counts)，用于测量细胞增殖。NTR 动力学图表（上排）显示，在两个细胞系中，MK2206 对 Akt 产生浓度依赖性抑制。对同一细胞进行红色荧光计数（中排），结果表明，MK2206 对 Akt 的抑制对两个细胞系的增殖具有不同的影响，MK2206 对 T-47D 细胞产生浓度依赖性抑制，但对 MDA-MB-231 细胞几乎没有影响。在两个细胞系中，环己酰亚胺处理对细胞增殖有抑制作用，但未影响 Akt 活性。下排图中显示了红色荧光计数的 IC50 图表 (24 h) 及核转位比率 (72 h)。在两种细胞类型中，通过 NTR 测定 Akt 抑制的 IC50 相同，但与 MDA-MB-231 细胞相比，T-47D 细胞中红色荧光计数的 IC50 明显向左偏移。