在 3D 培养模型中重现肿瘤微环境

要有效分析基于 3D 支架的多肿瘤球可能颇具挑战。传统的酶标仪分析缺少基于图像的多方面分析，包括分析形态信息和确认图像中数据的功能。由于多种因素，传统的成像系统本身就难以适应体外培养模型的动力学分析，主要原因如下：

• 数据不完整：成像间隔之间的信息缺失
• 多重不受控制的环境波动： 细胞在培养箱和成像系统之间来回转移，同时培养箱外冗长的 3D 图像采集方案会造成温度差异，且无法控制氧气和二氧化碳浓度
• 理想的图像采集参数开发非常耗时
• 图像处理复杂，需要专家级操作人员生成定量信息

Incucyte^® 3D 多肿瘤球分析方案可提供集成式的完整解决方案，在组织培养箱内实时自动追踪和定量肿瘤球的形成、生长和健康状态。

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• 生成可重现的定量数据：通过经实验室测试的方案、高质量图像和客观分析获得适用于药理学分析的可靠数据。
• 获得更多生理相关信息：无标记生长定量和 Matrigel^® 层表面或嵌入其中的 3D 多肿瘤球模型培养物的形态学研究- 在培养箱中不受干扰得进行。
• 揭示细胞随时间的变化：使用无干扰型试剂进行活力和毒性的实时多重测定，研究作用机制。
• 进行生物学相关的共培养分析：结合额外的细胞类型，重现肿瘤微环境，并研究细胞随时间的变化。

通过经实验室测试的方案、高质量图像和客观分析获得适用于药理学分析的可靠数据

图 1. Incucyte^® 经实验室测试的多肿瘤球模型方案可减少 3D 细胞培养中解决难题的时间，无需反复实验即可获得适合定量分析的图像。

无标记生长定量和 Matrigel^® 层表面或嵌入其中的 3D 多肿瘤球模型培养物的形态学研究-在培养箱内部不受干扰得进行。

图 2（视频）监测多肿瘤球生长并揭示肿瘤球形态随时间的变化情况。接种 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞（1K 细胞/孔）并在 Matrigel^® 层上或嵌入 Matrigel^® 基底内部形成多肿瘤球（3 天）。通过延时视频监测肿瘤球随时间的生长情况（形成后的 0-7 天），可见多肿瘤球出现圆形 (MCF-7) 和星形 (MDA-MB-231) 的形态学差异。

图 3. 使用实时分析定量细胞类型依赖性无标记生长曲线。在 96 孔平底板中，将 MCF-7 和 MDA-MB-231 嵌入 Matrigel^® 基底(1K 细胞/孔)，等待 3 天形成肿瘤球。分隔的（黄色轮廓）DF 明场图像和相应的时程曲线显示细胞类型特异性动力学生长曲线，并展示了喜树碱对肿瘤球生长的抑制作用。

使用无干扰型试剂进行活力和毒性的实时多重测定，研究作用机制。
*仅在 Matrigel^® 层模型使用多肿瘤球时才能获取荧光图像。

图 4. 通过动力学、生长和细胞健康多重检测，确定细胞毒性与细胞抑制作用机制。在含有 Incucyte^® Annexin V 绿色染料 (1%) 的情况下，接种带有 Nuclight 红色标记的 A549 细胞（2 K 细胞/孔），等待 3 天形成肿瘤球。在接下来的 6 天里，用不同浓度喜树碱 (CMP) 或环己酰亚胺 (CHX) 处理肿瘤球并成像。(A) 在处理后第 4 天对明场（BF，上行）、Incucyte^®Nuclight 红色染料（指示细胞活力的核限制性荧光蛋白 (FP)，红色荧光，中间行）和 Incucyte^®Annexin 绿色染料（凋亡标记物，绿色荧光，下行）图像进行对比。(B) 在 CMP 处理的肿瘤球中观察到生长缓慢（BF 区域的时程曲线），BF 边界范围内整体红色强度降低（红色荧光时程曲线），以及平均绿色荧光强度的同步增加（绿色荧光时程曲线）。尽管 CHX 抑制肿瘤球生长，RFP 表达水平仍然较高，然而绿色荧光强度少量增强，这表明观察到少量的细胞死亡，这与已知细胞生长抑制剂的预期相符。CMP 处理后使用 0-6 天的 AUC 数据得出的 EC₅₀ 表现出浓度依赖性的细胞活力丧失和细胞凋亡增加，而 CHX 的 EC₅₀ 值显示，活力几乎没有变化，且细胞凋亡没有增加，这与预期的作用机制相符。

图 5. 在生理相关条件下进行稳定可重现的药理学分析。带有 Nuclight 红色标记的 MCF-7 多肿瘤球形成 3 天后，使用已知的细胞毒性化合物处理 7 天。采用孔板时程视图可以快速观察化合物处理对肿瘤球大小（总 BF 面积）和活力（BF 内红色 FLU 强度）的影响。使用浓度响应曲线可进行处理后 0-7 天时程数据的曲线下面积 (AUC) 分析。所有化合物均能够导致肿瘤球的浓度依赖性生长和活力抑制，化合物效力的排列顺序为 CMP > CHX > OXA。

结合额外的细胞类型，重现肿瘤微环境，并研究细胞随时间的变化。

图 6.可视化并定量基质细胞对多肿瘤球形态学的影响，并评估多肿瘤球内部的免疫细胞介导毒性。(A) 将 MDA-MB-231 细胞接种到 96 孔平底板的 Matrigel^® 基底上，单独培养或与 NHDF 共培养（比例 1:1，各接种 1K 细胞/孔），形成多肿瘤球（3 天）。Incucyte^®DF-明场 (DF-BF) 图像比较了单独培养和共培养条件下培养 3 天的情况（细胞接种后 6 天）。注意 NHDF 对肿瘤球形态学的时间影响。(B) 将稳定表达细胞质限制性 GFP 的 BT474 细胞接种到 Matrigel^® 基底上（1K 细胞/孔），形成多肿瘤球（3 天），然后加入新鲜分离的 PBMC (E:T, 5:1) 和赫赛汀。Incucyte^®DF-BF 和荧光图像（7 天）比较了 PBMC 存在（上图）和不存在（下图）的条件下赫赛汀对肿瘤球增殖的影响（黄色明场 outline mask）。注意，PBMC 存在时，肿瘤球的荧光强度会减弱。时程曲线显示，绿色荧光强度随赫赛汀浓度增加呈依赖性降低，表面靶细胞生存力降低。赫赛汀浓度响应曲线显示了 HER2 阳性和 HER2 阴性多肿瘤球的灵敏度差异（分别是 BT-474 和 MCF7）。