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抗体内化研究新路径：高效细胞内化实验技术

生命科学研究
25年9月16日  |  8 分钟 阅读时间

抗体药物研发的每次突破，都源于对细胞过程的深入理解。

单克隆抗体（mAb）和抗体偶联药物（ADCs）的内化程度和速度是决定它们的疗效、安全性和药效曲线的关键。

抗体内化（Internalization）是指抗体与其在细胞表面的特定靶点（抗原）结合后，整个复合物被细胞膜包裹、内陷，最终脱离细胞膜进入细胞内部的过程。这并非被动扩散，而是一个主动、程序化的精密运输。

以ADC药物为例，其“弹头”只有在细胞内释放才能更好地起到靶细胞杀伤作用，内化效率低，意味着药物大部分滞留在细胞外，无法发挥作用，直接导致治疗失败。因此，充分了解抗体在胞内的内化进程，从而比较不同抗体的摄取情况，对于生物药研发中抗体筛选与优化至关重要。而传统内化检测的手段（如流式的方法）在实际应用中的存在明显困境：

  1. 繁琐流程：降温、升温、洗涤、升温、标记、洗涤、检测... ... 一步都不能少
  2. 时间断层：只能获得单个时间点的“快照”或单点数值结果，错过动态过程
  3. 结果失真：频繁操作干扰细胞状态，数据偏离真实情况
  4. 无法溯源：由于缺乏动态图片信息辅助判断，只能毫无方向的重复实验
  5. 缺乏洞察：仅能获取单点时间结果，无法获取时空信息及细胞状态等

正如某药企客户坦言：“我们需要的不是更多数据，而是更真实、更连续的数据。” 因此，研发人员迫切需要一种高效简便的方法，在活细胞状态下进行实时分析快速地定量抗体内化水平。

Incucyte® 实时活细胞分析系统，彻底改变了这一局面。它能在细胞培养箱内实现不间断、无标记的动态监测，让研究人员能够真正做到实时原位洞察细胞的“内心”世界。

 

技术革命：Incucyte® 如何改变游戏规则

1. 巧妙的pH敏感染料设计

如上图所示，Incucyte® 采用的Fabfluor-pH染料就像一位“智能侦探”：中性环境中保持“低调”，表现为无/微弱荧光信号;一旦进入细胞后，由早期内体-晚期内体-溶酶体，随着酸性环境增强，逐渐“活跃”，荧光信号逐渐增强。这一明一暗的变化，让研究人员能够实时目睹抗体从结合到内化的全过程。

2. 极简的操作流程

相比于，需要多步标记 → 多次洗涤 → 单时间点检测 → 数据解析的传统方法，Incucyte® 方法（仅需三步），添加染料 → 无需洗涤 → 连续监测 → 自动分析。

“从样品放入培养箱那刻起，我就可以专注于其他工作，系统会自动完成一切。”——某资深研究员这样分享 

Incucyte® 进行内化评估优势突出：

  • 实时动态监测：培养箱内连续数周无人值守监测，以及分钟级时间分辨率，精准捕捉每一个细节变化。
  • 真实无干扰：无需洗涤，一步法标记试剂，原位无损检测，最大限度保持细胞自然状态，减少人为操作引入的误差。
  • 高通量高效：6个板位独立运行，通量提升6倍，自动化数据分析，节省90%处理时间。
  • 定量精准，一次分析即可得到丰富数据：可同时输出生长曲线、荧光强度、细胞形态等多参数。定量结果展示形式多样，如动力学曲线图、整板视图、柱状图、阳性细胞百分比、EC/IC50曲线图，充分满足各种场景数据展示需求，再也不用导出数据第三方分析。

图1. Incucyte® FabFluor标记的α-CD71抗体内化到HT1080细胞的动态分析。HT1080细胞分别用FabFluor标记的a-CD71和IgG处理，用10X镜头，相差成像和红色荧光成像，拍照间隔15min，共计12h。与同型对照IgG(B)对比，a-CD71标记的实验组(A)有明显的红色荧光，表明该抗体能内化到HT1080细胞内;(C) Incucyt®软件动力学定量曲线图，抗体内化随时间逐步增加。

图2.  6种抗体8个浓度梯度经Fabfluor标记后内化到HT1080细胞的整板视图（图A和B）和柱状图（图C，12h内化结果）。发现AB1a,AB1b,AB2这3种抗体在低浓度时即有明显内化现象；AB3,AB4,AB5只在高浓度时才会发生内化。

图3. 细胞分别进行8个浓度点阳性抗体（UC-961）及阴性IgG1处理，软件可直接拟合得到UC-961的EC50值为0.614μg/ml。

图4. HT-1080 细胞中 Incucyte® Fabfluor-pH 标记的CD71抗体 与 LysoSensor® Green 的共定位信号提供空间洞察. 先将标记抗体（4 μg/mL）在 HT-1080 细胞中内化 3 h，然后在加入 LysoSensor® Green DND-189（Thermo: 0.25 μM）30min后，20倍镜拍摄。结果发现仅3h，已内化的抗体就有74%到达了溶酶体（图A为溶酶体绿色信号，图B为抗体内化红色信号，图C为红绿信号的merge图，图D为黄色的共定位分析，图E是图A-B-C的定量结果） 。

3. 全面覆盖抗体/ADC基础研究及药物开发

无论是快速评估候选分子内化特性、还是优化ADC连接子与载荷、抑或是拓展ADC杀伤动力学研究、ADC旁观者效应研究，甚至是深入洞察内化机制等，Incucyte® 均可以提供近乎完美的整体解决方案。

案例一：赛诺菲的ADC药物研发

SAR408701（Tusamitamab Ravtansine）是赛诺菲研发的“First-in-Class”靶向CEACAM5的ADC药物，目前正处于III期临床（NCT04154956），以进一步确认该标志物在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中的疗效。在临床前研究中，研究人员使用Incucyte®精准量化了该药物的内化动力学，为后续临床试验提供了关键数据支持。

案例二：Byondis公司的ADC药物优化

Byondis公司开发的ADC药物BYON3521，由靶向c-MET的人源化IgG1单克隆抗体SYD2884和被称为vc-seco-DUBA的可切割连接子药物组成，目前处于I期临床阶段。临床前研究中，Incucyte®不仅检测了该药物的出色的内化能力（左图），还意外发现了该ADC可以介导显著的旁观者效应（右图），即在MET阳性癌细胞存在情况下，药物对MET阴性癌细胞的杀伤能力，这一发现帮助团队更好地理解了药物的作用机制。

客户评价：

在抗体药物研发中，理解内化过程不再是‘锦上添花’，而是‘必不可少’，而Incucyte® 让这一关键步骤变得直观、可控、可量化。

——某知名药企客户

 

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