流式细胞术可以用来测定什么？

1、流式细胞术的基本原理

流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用来分析并测量单个细胞特征的技术。流式细胞仪的工作原理是将经过标记处理的细胞样本在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态和表面标记物等信息。最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。

流式细胞仪利用标记物的荧光信号来识别和分析细胞的特征，不仅能够帮助研究人员了解细胞表型和功能，还广泛应用于临床诊断、药物筛选和疾病研究中。

2、流式细胞术的特点

赛多利斯iQue^® 3 采用先进的流式细胞术平台，专注于加快整体工作流程，具有以下特点。

• 快速：在整个实验过程中采用快速的平板取样、综合分析和新型数据约减工具来突破容量瓶颈，5分钟即可完成一块96孔板的检测与分析。
• 微量化：通过从微量样本中采样，最少只需一微升 , 节约珍贵的样本和试剂。
• 高内涵：同时测量同个孔中的表型和细胞因子，可生成更多生物相关数据。
• 易用性：利用可易于实现的自动化功能，可打造简单、可扩展的多用户环境，包括 48 小时不间断运行和自动化板载QC微球振荡；工作流程导向的软件界面，试剂盒自带采集和分析模板。
• 洞察力：利用新颖的可视化工具可显著缩短决策时间，即使是从复杂的数据集中也可以在短时间内获得可操作结果，可整板显示直方图、散点图和叠加的直方、散点图，自动计算IC50/EC50。

3、 应用

（1）细胞健康和增殖分析

增殖、细胞凋亡和细胞毒性是细胞健康的重要衡量指标，能够研究药物、培养条件和基因改造对细胞生长或活力的影响。

• 细胞计数

流式细胞术的研究早已不仅局限于定性检测，更注重定量分析，通过加入荧光参比微球使得流式细胞仪获得细胞绝对计数的结果。

iQue^® 细胞计数和活力分析试剂盒可在 96 孔和 384 孔板中在宽线性范围内获得高准确度，对来自各种非贴壁细胞系的绝对细胞计数和活力数据进行可重现的分析。该试剂盒可识别活细胞，免清洗步骤，并且包括经过验证的预设分析模板，可结合iQue^® 流式细胞仪快速筛选和分析。

图1. 对各种比率的生长细胞与热灭活细胞（Jurkat、Raji 或 Ramos 细胞系）的混合物进行测试，以确保整个灵敏度范围内的线性相关性。

图2. 模板化圈门和分析

• 细胞活力

当通过流式细胞术进行细胞分型时，将死细胞排除在最终数据分析之外，确定细胞活力十分重要。目前有许多固定活力染色法可用于量化细胞活力，但是这些方法与固定方案不兼容，最终可能导致在数据集中出现伪影。

iQue^® 可固定活力染料是一种区分活细胞和死细胞的氨基活性不透膜染料。染色的细胞可以固定和透化，使染料与下游细胞内染色相容，并且强度不会有任何减弱。iQue^® 可固定活力分析试剂盒有三种不同颜色可供选择，可以满足流式多色 Panel 的需求。

图3. iQue^® 可固定活力染料染色的 PBMC 的细胞内 IFN-γ 表达检测和分析实例。

• 细胞凋亡

细胞凋亡是正常组织发育和内稳态的重要过程，细胞通过该过程适时发生程序性细胞死亡。在大多数情况下，细胞凋亡的诱导导致线粒体去极化、Caspase 激活和质膜改变。同时检测多种细胞凋亡标志物能够确认细胞凋亡途径并深入了解随时间变化的作用机制。

图4. 细胞凋亡标志物：1) 线粒体去极化，2) Caspase 3/7，3) Annexin V，4) 死亡。
iQue^® 人四重细胞凋亡分析试剂盒不仅可以在单个样品中同时检测 Caspase 3/7 活化、Annexin V 结合、细胞活性和线粒体去极化（图 21），还可计算细胞总数，以识别剧毒的药物。根据实验目的，四种试剂可以同时使用（图5(A) 和图5(B)），也可以相互组合使用，无需清洗。细胞凋亡试剂也可以与其他 iQue^® 试剂联合使用实现多重分析。

图5. 当用诱导细胞凋亡的药物处理时，细胞健康标志物表现出时间依赖性增加。

将 Jurkat 细胞 (1e6 个细胞/mL) 用各种浓度的星形孢菌素进行处理。在使用 3 种细胞凋亡试剂处理 2 h、6 h 和 24 h 后，取 20 µL 样品进行分析。(A) 在 2 h 时半胱天冬酶阳性细胞百分比 (%) 的热图，(B) 线粒体去极化，(C) Caspase，(D) Annexin V。

（2）免疫细胞功能分析

免疫细胞根据其周围环境具有不同而复杂的反应和功能。根据这些混合表型的细胞表面标记表达和/或分泌的可溶性介质来鉴定免疫细胞对于发现新治疗方法至关重要。

• T细胞活化

抗原和共刺激信号对初始T细胞的活化启动了CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞的克隆扩增。T细胞活化分析的监测和定量能够帮助我们更好地理解T细胞如何对某些刺激作出响应。

图6. iQue^®人T细胞活化分析试剂盒的分析原理示意图。

不同T细胞表型分析主要通过检测3个活化标志物的表达：CD69（早期）、CD25（晚期）和 HLA-DR（更晚期）。还可以使用2-plex Qbeads，通过夹心法免疫分析，在同一孔中定量分析 2 种效应细胞因子（IFNγ 和 TNFα）。

图7. 通过T细胞活化分析试剂盒进行T细胞表型和细胞因子释放分析。

• T细胞杀伤

细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL)是免疫系统的功能性 (CD8+) 细胞亚群，可释放穿孔素，在靶细胞膜上形成孔洞，颗粒酶通过这些孔洞进入细胞，诱导靶细胞凋亡。

图8. iQue^® 人 T 细胞杀伤分析试剂盒的分析原理示意图。

通过 CD8+ T 细胞的状态分析，可检测活化标志物 CD25 和耗竭标志物 PD-1，还可以使用 2-plex Qbeads，通过夹心法免疫分析，在同一孔中定量分析 2 种效应细胞因子（IFNγ 和颗粒酶 B）。

图9. 通过 iQue^® 人 T 细胞杀伤分析试剂盒进行 T 细胞表型和细胞因子释放分析。

• NK细胞杀伤

评估NK细胞介导新疗法的关键过程之一是定量分析NK细胞活化和肿瘤杀伤能力，以深入洞察潜在的疗效。

图10. iQue^® 人NK细胞杀伤分析试剂盒的分析原理图解。

iQue^® 能够在一个孔中同时进行靶细胞识别、细胞健康、细胞功能、免疫分型和细胞因子分析。靶细胞通过荧光编码染料染色与效应细胞区分开来，然后通过荧光细胞膜完整性染料进行染色，检测肿瘤细胞杀伤效果。使用 CD3、CD56 和 CD16 识别 NK 细胞，使用 CD69 和 CD25 评估细胞的活化状态。在同一孔中，使用 2种 iQue^® Qbeads^®，通过夹心法免疫分析对促炎细胞因子干扰素 γ (IFNγ) 和促凋亡丝氨酸蛋白酶 - 颗粒酶 B 的产生进行定量分析。还可以使用人 NK 细胞配套试剂盒分析其他细胞因子。搭配iQue^® 人NK 细胞配套试剂盒，还可以检测6 种额外的人细胞因子和效应蛋白。

• T细胞记忆

疫苗和过继性细胞转化免疫治疗方案都会受记忆T细胞异质性的影响，能够使用单个方法鉴别这些功能不同的记忆T细胞亚群对于免疫治疗具有重要意义。

图11. iQue^® 人T细胞记忆分析试剂盒的分析原理示意图。在单个孔中同时测量活化标志、细胞增殖和细胞因子。

通过 CD3、CD4 和 CD8 标志物的染色检测 T 细胞的基本表型。通过 CD45RA、CD45RO、CD27、CD62L 和 CD95 标志物的染色检测 T 细胞活化后不同分化阶段的 T 细胞亚型（TN、TSCM、TCM、TTM、TEM、TEMRA 和 TTE）。在同一个孔中，还可以通过夹心法免疫分析，使用 Qbeads 定量分泌的促炎细胞因子 IFNγ 和抗炎细胞因子 IL-10。使用膜完整性荧光染料进行染色，区分活免疫细胞与死细胞。

• T细胞耗竭

T细胞耗竭是指长期刺激造成的 T 细胞功能障碍。耗竭性t细胞可表现出独特的表型，包括抑制性标志物（例如 PD-1、LAG-3 和 TIM-3）过度表达，以及 T 细胞释放促炎性细胞因子（IFNγ 和 TNFα）的能力减弱。

图12. iQue^® 人 T 细胞耗竭分析试剂盒的分析原理示意图。

T 细胞表型分析主要通过检测 3 个耗竭标志物的表达：PD-1（早期）、LAG-3（中期）和 TIM-3（晚期）。还可以使用 2-plex Qbeads，通过夹心法免疫分析，在同一孔中定量分析 2 种效应细胞因子（IFNg 和 TNFα）。

• TIL和MLR

以温和方式分离 3D 肿瘤模型，从而对 T 细胞浸润进行定量分析：

图13. 使用 iQue^® 高通量流式细胞仪平台对肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）进行体外分析的方案示意图。

MLR通过将来自两个个体的免疫细胞进行共培养，以触发免疫检查点调控所需的“非自体”识别：

图14. 混合淋巴细胞反应 (MLR) 的分析原理示意图

对T细胞表型和功能的全面评估对于理解T 细胞生物学和建立更好的治疗方法至关重要。iQue^® 高通量流式细胞仪搭配基于免疫细胞和微球的试剂盒为免疫细胞功能表征提供全新解决方案。智能Forecyt^® 软件自动生成直方图、剂量反应曲线以及整板可视化数据结果，简化流式分析，提供更多见解。

（3）抗体表征

• 抗体依赖性细胞吞噬作用 (ADCP)

抗体依赖性细胞吞噬作用 (ADCP) 是一种免疫消除机制，其凭借单克隆抗体(mAb) 靶向肿瘤细胞，以促进吞噬免疫细胞将肿瘤细胞从体内清除。

iQue^® 的 ADCP 利用 iQue^® 人抗体依赖性细胞吞噬作用试剂盒，通过精简的工作流程对活靶细胞与 CD14+ 原代效应细胞的共定位进行定量，实现 ADCP 的高通量测定。

图15. iQue^® 人抗体依赖性细胞吞噬作用试剂盒分析原理示意图。

在 96 孔板或 384 孔板中，将 iQue^® 增殖和编码（B/绿色）染料标记的靶细胞与测试抗体共孵育，然后加入未标记的效应细胞（PBMC 或富集的单核细胞或巨噬细胞群）。

使用 iQue^® 细胞膜完整性（R/红色）染料分离活细胞与死细胞。将根据靶细胞编码器呈阳性的活的 CD14+ 效应细胞的百分比对 ADCP 进行定量。

图16. 简便的 iQue^® 人抗体依赖性细胞吞噬作用试剂盒实验方案。

• 抗体内化

细胞表面抗原特异性的抗体会诱导内吞作用，从而导致这些抗体以及与其结合的任何分子一起被细胞内化，这一过程被称为抗体内化（ABI），在研究和临床发现方面具有许多强大的应用。

图17. pH 敏感荧光探针原理。

iQue^® 抗体内化试剂盒提供一种新型 pH 敏感荧光探针能够在完整的含血清培养基中快速、无需洗涤地标记同种型匹配的抗体。当内化抗体被加工到酸性内体和溶酶体途径时，会产生荧光信号。抗体内化被量化为荧光探针呈阳性的活细胞的百分比。使用随附的 iQue^® 细胞膜完整性染料可以同时测量细胞活力。

图18. iQue^® 抗体内化试剂盒示意图。

• 抗体结合分析

iQue^® 抗体结合测定和工作流程可以帮助识别和表征抗体与靶点的结合。我们提供两种检测方法：第一种是直接抗体结合测定，可以根据与靶细胞的结合对 mAb 进行排序，并能够在单个孔中分析与多种细胞类型的结合。第二种是竞争性结合测定，可以揭示针对不同表位的单克隆抗体。

图19. 直接抗体结合测定工作流程。

图20. 竞争抗体结合测定工作流程。

• 补体依赖细胞毒性分析

抗体疗法的三个关键 Fc 介导功能是抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用 (ADCP) 和补体依赖性细胞毒性 (CDC)。在 单克隆抗体（mAb） 开发过程中，必须分析新型 mAb候选物的 CDC 活性，以全面了解其 Fc 介导的抗肿瘤功能。

图21. 使用高通量流式细胞术进行 CDC 测定的工作流程示意图

我们提出了一种简单、简化的检测方法，使用 iQue^® 高级流式细胞术平台测量单克隆抗体针对活靶细胞的 CDC 活性。在人血清存在的情况下用感兴趣的单克隆抗体培养靶细胞，其中含有启动补体级联以及随后在细胞上形成膜攻击复合物所需的蛋白质。使用 iQue^® 细胞膜完整性（R/红色）染料标记细胞，以定量细胞死亡作为 CDC 活性的指标。

（4）基于微球的多细胞因子分析

生物学相关分泌蛋白和细胞因子的定量在基础研究和药物开发中至关重要，对于理解炎症和肿瘤学中的 T 细胞活化和细胞信号级联放大作用等都有极大帮助。

借助丰富的 iQue^® Qbeads^® Plexscreen 的系列试剂，研究人员可通过不同类型的微球捕获来分析分泌蛋白，从而实现生物参数的多重定量。用户可以将 iQue^® Qbeads^® 检测与其他 iQue^® 分析试剂盒结合使用，通过简化的无缝工作流程，对蛋白质分泌、细胞活力、标志物表达和增殖进行高通量测量。

图22. 使用 iQue^® Forecyt^® 软件系统快速方便地分析数据。

图23. 分泌信号分子和细胞功能的多重定量。

（5）其他

• iPSC诱导多能干细胞分析

2020年时，阿斯利康改良Crisper-cas9技术，开发了一种ObLiGaRe强力霉素诱导型SpCas9(ODInCas9)转基因小鼠模型，靶向ObLiGaRe导致人类或小鼠细胞的功能整合，最终产生ODInCas9小鼠，并且验证发现这种小鼠体细胞体内编辑可以模拟非小细胞肺癌 (NSCLC) 腺癌，使治疗研究能够验证候选药物的功效。在判断基因编辑成功与否时，应用到Incucyte^® 检测细胞增殖，并联合使用iQue^® 及Incucyte^® 筛选GFP阳性的细胞。

图24. 高通量筛选编辑成功的GFP阳性细胞。

将各种不同组织细胞以及iPSC细胞导入OdInCas9，抗生素筛选后进行单克隆挑选培养，用Incucyte^® 拍照成像，识别GFP阳性细胞，为确定是否真正导入OdInCas9，加入Dox诱导GFP表达，细胞消化后放入96孔板，用我们的iQue^® 鉴别GFP阳性细胞。