研究免疫细胞杀伤

了解患者自身免疫系统在保护身体抵御肿瘤方面的作用至关重要。 这种抗肿瘤反应的一个关键组成部分在于某些免疫细胞(如细胞毒性 T 细胞和自然杀伤细胞)能够通过免疫细胞杀伤 (ICK) 过程诱导恶性细胞死亡。因此,体外模拟 ICK 十分重要。有多种传统技术可用于评估 ICK,例如传统的流式细胞术和生化读数。这些技术虽然实用,但对细胞动态相互作用的了解有限。

  • “终点”固定和染色方案非常耗时,且每个时间点只产生单个图像
  • 需要多个清洗步骤,并且必须使用放射性或抗体标记进行定量
  • 需要连接来自不同样品(分析孔)的数据以构建时程,可能会引入伪迹
  • 失去环境控制,导致细胞发生变化,这可能产生不理想和误导性的实验结果

使用 Incucyte® 免疫细胞杀伤分析方案可轻松实现对免疫细胞和癌细胞的动态相互作用的可视化、定量分析和理解。该分析可作为现有的免疫或肿瘤免疫学方案的补充,使用非侵入性、非破坏性平台分析细胞健康、表型、亚群和功能,为免疫细胞、抗体功能和杀伤提供新信息。


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应用指南:

将活细胞分析和流式细胞仪结合到单一工作流程中,深入了解免疫细胞的杀伤机理

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应用

Incucyte® 免疫细胞杀伤实验

Incucyte® 免疫细胞杀伤实验将实时自动分析与非干扰性活细胞试剂相结合,在您的组织培养箱中就可对免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤进行直接多重测量。此灵活分析平台非常适合测定:

  • 细胞毒性 T 细胞杀伤
  • 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)
  • 肿瘤球模型中的免疫细胞杀伤

使用 Incucyte® 活细胞分析系统采集的延时视频可通过传统 2D 和更复杂的 3D 模型对肿瘤细胞杀伤作用进行实时可视化。

首先可观察到抗 CD3 抗体和 IL-2 活化的 PBMC T 细胞亚群对靶标 SK-OV-3 肿瘤细胞发挥杀伤作用。使用 Incucyte® Nuclight 红色慢病毒对 SK-OV-3 癌细胞进行标记,可以直接计数活肿瘤细胞数随时间的变化。添加 Incucyte® Caspase-3/7 试剂可以同时检测发生凋亡的细胞(绿色荧光)。

之后可使用 Incucyte® Cell-by-Cell 分析软件定量分析并绘制总靶标和效应细胞增殖情况以及靶标的凋亡指数。在加入 Incucyte® Annexin V 绿色染料的情况下,将 Nuclight 红色标记的 Ramos 细胞与活化的人 PBMC 共培养,从而对亚群靶细胞增殖、靶细胞死亡和免疫细胞增殖进行定量分析。最后,观察并定量分析了免疫细胞对球体模式下 A549 癌细胞的免疫细胞杀伤。将 Nuclight 红色标记的 A549 球体模型与未活化和活化的 PBMCs 共培养。

Incucyte® 免疫细胞杀伤检测原理


  1. 靶肿瘤细胞与所选择的免疫细胞(例如,T 细胞或人外周血单核细胞;PBMCs)共培养。
  2. 通过将即混即读的 Incucyte® Caspase-3/7 绿色/红色试剂或 Incucyte® Annexin V 红色/绿色试剂添加到培养物中,即可直接实时检测肿瘤细胞的死亡情况。
  3. 自动图像分析能够对肿瘤细胞死亡进行选择性定量。可选:通过使用多种 Incucyte® Nuclight 标记试剂标记靶细胞,从而实现肿瘤细胞同时计数。使用 Incucyte® Cytolight 红色或绿色快速试剂可以识别不易标记的细胞。
  4. 使用 Incucyte® Cell-By-Cell 分析软件模块(产品目录号9600-0031)进行分析,可以对标记的靶细胞群和未标记的效应细胞群(增殖和死亡)进行定量。对于贴壁靶细胞,该软件使用户能够在靶细胞存在的情况下追踪效应细胞群。

关键优势

定量分析实时、动态的细胞相互作用

观察和定量分析免疫细胞和癌细胞之间的动态相互作用,从而揭示复杂共培养模型中的细胞间相互作用和免疫突触。

图 1A. 利用 Incucyte® 免疫细胞杀伤实验可视化免疫细胞/肿瘤细胞的相互作用。(1) 细胞毒性 T 细胞(较小)和标记的肿瘤细胞(较大,红色)之间的物理接触。T 淋巴细胞分裂。(2) 肿瘤细胞被细胞毒性 T 淋巴细胞攻击:“死亡之吻”。(3) 肿瘤细胞形成胞质颗粒,Caspase 3/7 标记(绿色),核固缩,细胞死亡。(4) 肿瘤细胞有丝分裂:一个细胞分裂为两个。

图 1B. 使用 Incucyte® Fabfluor-488 可视化并定量分析混合培养物中免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用。将带有 Cytolight 红色标记的 A549 肿瘤细胞与 Incucyte® Fabfluor-488-α-CD45 和 Incucyte® Opti-Green 标记的总淋巴细胞群的预活化或未活化的 PBMC 混合。添加 PBMC 后 2 小时采集的图像显示了 CD45+ 细胞(绿色)和 A549 细胞(红色)之间的相互作用。相互作用的定量分析结果(叠加,图像中的黄色 mask)显示,活化的效应细胞与靶细胞的相互作用明显增加,表明细胞参与了对肿瘤细胞的免疫杀伤(如柱状图所示)。使用 Incucyte® Cell-By-Cell 分析软件模块进行分析。

分析肿瘤细胞死亡和活力

使用无干扰性试剂和直观的 Incucyte® 图像分析工具定量分析肿瘤细胞的活力和死亡或免疫细胞增殖。

图 2A. 使用 Incucyte® 免疫细胞杀伤实验进行贴壁肿瘤细胞和效应细胞增殖、死亡和亚群分析。在含有 Incucyte® Annexin V 橙色染料、Incucyte® Fabfluor-488-α-CD45 抗体复合物和 Incucyte® Opti-Green 背景抑制剂的情况下,使用 Incucyte® Nuclight NIR 慢病毒转染的 A549 细胞与数量增加的活化(顶行)或非活化(底行)的 PBMC 共培养。 定量分析 NIR(蓝色)细胞核显示靶细胞增殖,橙色荧光区域 (Annexin V) 显示靶细胞死亡。使用 Incucyte® Cell-by-Cell 分析软件模块可在存在肿瘤细胞的情况下定量总效应细胞数,无需标记。添加 Fabfluor-CD45 表明 > 80% 是 CD45 阳性免疫细胞。

图 2B. 使用 Incucyte® Cell-by-Cell 分析模块测定非贴壁靶细胞和效应细胞增殖、死亡,以及进行亚群分析。在含有 Incucyte® Annexin V NIR 染料、Incucyte® Fabfluor-488-α-CD8 抗体复合物和 Incucyte® Opti-Green 背景抑制剂的情况下,使用 Incucyte® Nuclight 橙色慢病毒试剂转染的 Ramos 细胞与活化或非活化(使用 CD3/IL2)的 PBMC 共培养。定量分析橙色(红色)细胞核显示靶细胞增殖,NIR(蓝色)荧光区域显示靶细胞死亡。使用 Incucyte® Cell-by-Cell 分析软件模块可定量分析并绘制总目标细胞数和效应细胞数,以及靶细胞的凋亡指数随时间变化的图表。

使用高度灵活的分析形式研究免疫细胞杀伤

评估多种相关模型,包括与贴壁或悬浮肿瘤细胞与 PBMCs、细胞毒性 T 淋巴细胞和 NK 细胞的共培养模型。在 T 细胞介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 形式中选择使用所需的效应细胞和靶细胞,定量分析并可视化肿瘤球模型中的免疫细胞随时间的杀伤作用。

图 3A. ADCC: 在免疫细胞杀伤肿瘤球模型中,曲妥珠单抗(Herceptin®,赫赛汀)诱导免疫细胞杀伤 SKOV-3 卵巢癌细胞:对 HER2 阳性的 Nuclight 红色标记 SKOV-3 球体(2500 个细胞/孔)接种 PBMC(6250 个细胞/孔)并用赫赛汀(靶向 HER2 受体的 mAb)处理,连续拍照 10 天 (A)。通过荧光强度 (B) 评估赫赛汀对 SKOV-3 肿瘤球生长的抑制。

图 3B. ADCC: 曲妥珠单抗(赫赛汀)诱导免疫细胞杀伤 SKOV-3 卵巢癌细胞。PBMC 与 Nuclight 红色标记 SKOV-3(HER2 阳性)或 Nuclight 红色标记 A549(HER2 阴性)肿瘤细胞共培养。在 SKOV-3 (A) 中曲妥珠单抗诱导随时间对肿瘤细胞增殖产生受浓度影响的抑制作用,但对 A549 (B) 细胞没有作用。曲妥珠单抗抑制 SKOV-3 细胞增殖的浓度-响应曲线 (C)。含有和不含抗体(添加后 72 小时)的情况下未处理(顶部)和 masked-image(底部)示例 (D)。

通过优化的方案提升分析效率

在 96 孔板和 384 孔板中评估免疫细胞杀伤效果,无需细胞清洗、分离或进行放射性标记。

图 4A.简化工作流程,最大程度地获取信息。在 2D 或 3D 共培养模型中,将自动化图像和分析的强大功能与经过实验室测试的方案相结合,适用于贴壁或非贴壁靶肿瘤细胞

常用的免疫细胞杀伤分析方法

用于评估免疫细胞杀伤癌细胞的常用方法通常为终点法,需要分离细胞(例如流式细胞术)或测定肿瘤细胞活力的间接读数(例如 LDH、GAPDH 释放实验)或免疫细胞活化 (ELISpot)。这些读数通常均不基于图像。下表显示了一些常见方法的功能和挑战

Incucyte® 免疫细胞杀伤分析

流式细胞仪

51 Cr 释放实验

GAPDH/LDH 释放实验

DELFIA® TRF 检测

ELISpot

ADCC 报告基因生物测定 (Promega)

实时细胞可视化

 

集成分析

  

 

直接检测肿瘤细胞死亡

  

肿瘤细胞活力测定

  

 

 

 

评估长期杀伤作用 >24 小时

  

灵活选择靶细胞和效应细胞

  

 

 

 

 

ADCC 和 T 细胞杀伤形式

  

 

 

 

 

即混即读,无需清洗

 

 

384 孔通量

 

 

 

 

 

 

细胞可用于进一步分析

 

高灵敏度

  

 

 

 

 

非放射性

  

 

 

 

 

无需标记抗体

 

 

 

 


癌症免疫疗法发现 - Incucyte® 文献

Griffiths, G.M. et al. Loss of ARPC1B impairs cytotoxic T lymphocyte maintenance and cytolytic activity. J Clin Invest, 129(12):5600-5614, 2019

  • CD8 细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 依靠分支 F-肌动蛋白网络的快速重组来驱动裂解颗粒的极化分泌,从而在适应性免疫应答期间使靶细胞开始死亡。Incucyte® 活细胞分析系统用于监测 IL-2 缺乏后较长时间范围内靶细胞的损失

Adams, KJ et al. The use of induced pluripotent stem (iPS) cells for the safety testing of enhanced affinity TCR-transduced T cellsCancer Research, AACR; April 5-9, San Diego, CA, 2014

  • 针对一组代表人体主要器官的 iPS 培养物测试脱靶 T 细胞活性。Incucyte® 系统能够在 4 天内直接实时观察 Caspase-3/7 依赖性的细胞凋亡。

“在 51Cr 释放甚至 LDH 释放延长实验等短期杀伤实验中,可能会遗漏 ImmTAC 的重导向杀伤作用。因此,采用 Incucyte®™ 技术对于在尽可能严格的条件下评估 ImmTAC 效力和特异性至关重要。”

Adams, K. Redirected T cell activity by high affinity TCR-Anti-CD3 Bispecific candidate therapeutics. PhD Dissertation, Cardiff University (2013)

订购信息

产品

数量

产品目录号

Incucyte® Cell-by-Cell 分析软件模块

1 个模块

9600-0031

Incucyte® Caspase-3/7 绿色试剂

20 µl

4440

Incucyte® Caspase-3/7 红色试剂

20 µl

4704

Incucyte® Annexin V 绿色染料

1 vial

4642

Incucyte® Annexin V 红色染料

1 vial

4641

Incucyte® Annexin V 橙色染料

1 vial

4759

Incucyte® Annexin V NIR 染料

1 vial

4768

Incucyte® Nuclight 绿色慢病毒试剂 (bleo)

0.2 mL

4626

Incucyte® Nuclight 绿色慢病毒试剂 (bleo)

0.6 mL

4477

Incucyte® Nuclight 红色慢病毒试剂 (bleo)

0.2 mL

4627

Incucyte® Nuclight 红色慢病毒试剂 (bleo)

0.6 mL

4478

Incucyte® Nuclight 绿色慢病毒试剂 (puro)

0.2 mL

4624

Incucyte® Nuclight 绿色慢病毒试剂 (puro)

0.6 mL

4475

Incucyte® Nuclight 红色慢病毒试剂 (puro)

0.2 mL

4625

Incucyte® Nuclight 红色慢病毒试剂 (puro)

0.6 mL

4476

Incucyte® Nuclight 橙色慢病毒试剂 (puro)

0.2 mL

4771

Incucyte® Nuclight NIR 慢病毒试剂 (puro)

0.2 mL

4805

Incucyte® Cytolight 快速绿色试剂

1 瓶 (15 µg)

4705

Incucyte® Cytolight 快速红色试剂

5 瓶 × 50 µg

4706

Incucyte® Cytolight 橙色快速染料

1 瓶 (1 mg)

4839

Incucyte® 小鼠 IgG2a Fabfluor-488 抗体标记试剂

1 瓶 (50 µg)

4743

Incucyte® 小鼠 IgG2b Fabfluor-488 抗体标记试剂

1 瓶 (50 µg)

4744

Incucyte® 小鼠 IgG1 FabFluor-488 抗体标记试剂

1 瓶 (50 µg)

4745


资源

免疫细胞杀伤常见问题解答

查看全文

Incucyte® 免疫细胞杀伤分析方案

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Incucyte® 肿瘤球免疫细胞杀伤分析方案

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ELRIG 2017: Incucyte® S3 3D 免疫细胞杀伤

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ITOC 2016: 免疫细胞杀伤肿瘤细胞的新型活细胞动力学成像分析

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CIMT 2016: 用于免疫疗法的活细胞成像定量分析

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