混合模式层析

新的生物制药目标需要新的选择性,以获得较高的产品纯度。简单的工艺整合和经济效益是实施新模式的附加驱动力。 

为您的层析工艺寻求合适的解决方案

混合模式层析通常采用一种以上相互作用原理来进行纯化。尽管疏水作用和离子交换功能的结合是最常见的;结合阳离子配基和金属螯合亲和配基的羟基磷灰石填料HA Ultrogel也熟为人知。混合模式树脂展现出了独特的分离特性,并可简单的进行工艺整合,减少额外工艺步骤的要求。 


特性 

HA Ultrogel

CMM Hypercel 

MEP Hypercel

HEA Hypercel 

PPA Hypercel

配体 羟基磷灰石 氨基苯甲酸巯基乙基吡啶 己胺 苯丙胺 
粒径 

60 – 180 µm 

50 – 80 µm 

80 – 100 µm 

80 – 100 µm 

80 – 100 µm 

动态结合能力 (10% BT) 

> 7 mg/mL Cytochrome C 

60 – 100 mg IgG 

> 20 mg/mL hu IgG 

40 – 60 mg/mL BSA 

40 –60 mg/mL BSA 

工作pH 

5 - 13 

2 - 13 

2 - 12 

2 – 12 

2 - 12 


制备型和分析型整体柱

正确的色谱工具用于正确的任务——以及使用它们的技能。

了解更多

HA Ultrogel® – 羟基磷灰石

HA Ultrogel® –羟基磷灰石是一种三维交联的聚合填料,将羟磷灰石微晶包埋在琼脂凝胶球中。该材料展现了基于羟基磷灰石结构内阳离子交换和金属亲和的混合模式作用。它适用于一般杂质的去除。 

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引言

HA Ultrogel®树脂是一种羟基磷灰石-琼脂糖复合材料树脂,用于从研发规模到生产规模的生物分子分离。

羟磷灰石层析被认为是一种“伪亲和”层析或者“混合模式”离子交换层析。它已被证明是一种有效的纯化方法,适用于各种处理过程,为传统的离子交换或者疏水作用机理提供互补的生物分子选择性。

HA Ultrogel羟基磷灰石树脂是由交联琼脂糖粒和微晶羟基磷灰石组成,包裹在琼脂糖网中。粒径在60至180µm之间。HA Ultrogel孔隙率与琼脂糖凝胶相当,球状蛋白质的排阻极限为5000 kDa。这种大孔隙率避免了分离过程中的分子筛效应。

该树脂在含有20%乙醇的1 M NaCl中运输,可提供多种包装尺寸。以满足特定生产要求的特殊包装,可按需提供。   


特点

  • 独特的选择性和分离机理
  • 在中性、非变性条件下的蛋白纯化
  • 实验室规模至大规模生产的层析柱

羟基磷灰石层析法提供了一个温和、中性pH分离机制,不同于其他传统的方法,如离子交换或亲和。羟基磷灰石最为人熟知的应用是分离碱性蛋白质(细胞色素c、溶菌酶等)和磷蛋白。

HA Ultrogel®树脂可用于分离人血清蛋白质和植物蛋白质,如凝集素、糖蛋白、糖苷酶、磷脂酶、磺氢化酶、鞘磷脂酶、转移酶、海藻糖酶和激酶。 

HA-Ultrogel是一种含磷树脂,可用于分离与磷酸作用的蛋白质和酶以及与DNA相互作用的酶。


其他关键应用包括 :

  • 疫苗纯化过程(如百日咳杆菌毒素) 
  • 去除抗体纯化中的聚集体
  • 蛋白质异构体的分离 
  • 去除重组蛋白纯化过程中的杂质
  • 分离磷蛋白、酶、糖蛋白、EPO、受体 

HA Ultrogel®​ 树脂的主要特性

粒径

60 - 180 µm

羟基磷灰石含量

40 %

琼脂糖(重量/体积)

4 %

排阻极限

> 5,000,000 dt

工作和清洗pH

5 – 13

热稳定性

4 – 121 °C

细胞色素C结合能力*

> 7 mg/mL

BSA结合能力**

< 7 mg/mL

* 采用5 mg/mL细胞色素C在10mM磷酸钠缓冲液pH 6.9中以50/50稀释、在30 cm/h流速下测定。
** 采用1mg/mLBSA在10mM磷酸钠缓冲液pH 6.9中以50/50稀释、在12.5 cm/h流速下测定。

化学稳定性

HA Ultrogel®在碱性条件下稳定,可用0.1 M氢氧化钠进行重生处理和在位清洗。HA Ultrogel不能用会溶解羟基磷灰石晶体的pH <4的酸性溶液处理。


机械稳定性

和分离阶段(捕获、洗脱或清洗步骤)。工艺规模目前采用的典型流速为30至200 cm/h,柱体积大小为数升。
HA Ultrogel树脂在很温(高达121℃)下稳定仍能保持稳定。它可以采用高压灭菌而不改变其层析性质。但是,应在pH 7的缓冲条件下进行操作,以避免磷酸盐沉淀的出现盐。HA Ultrogel树脂不能冷冻。

HA Ultrogel®​ 树脂 

尺寸

货号

25 mL

24775-082

100 mL

24775-025

500 mL

24775-017

1 L

24775-041

10 L

24775-058

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HA Ultrogel®羟基磷灰石层析树脂

PDF | 497.6 KB

CMM Hypercel – 氨基苯甲酸

CMM Hypercel是一种疏水阳离子交换剂,建议用于抗体、抗体片段和重组蛋白的捕获。通过调节缓冲液的pH和电导率,它可分离与pIs相似的蛋白质。 

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引言

CMM hyperel树脂由刚性纤维素基质组成,具有与生产规模蛋白生产的需要相适应的流速特性。

同时含有伯胺和羧基的特有配体使得层析树脂具有阳离子交换和疏水性特性。在工作pH值(4 ~ 9)下,胺基不带电(pKa < 4)。羧基在pH(4到6)下带弱电荷,可与基于疏水性的蛋白质相互吸附。羧基在洗脱pH(7至9)下发生去质子化,通过负电荷排斥作用进行洗脱。配体的灵活性能够分离具有不同等电点和疏水能力的蛋白质,并且可以利用多种条件将目标分子与污染物分离。

树脂有多种规格:用于初期筛选的200和600μL Robo层析柱,可进行快速方法优化、选择性筛选或小型制备工作的1 mL和5 mL PRC预装柱。也可提供含有20%(v/v)乙醇的1M NaCl浆液/悬浮液CMM HyperCel树脂,或用于工业化生产的湿润饼状填料。湿润饼块树脂有利于树脂的转移,避免了大量物料的搅拌和悬浮形成。

CMM HyperCel树脂具有化学稳定性,确保了可进行简单的在位清洗(CIP)和储存。对于标准CIP,建议使用0.5至1 M NaOH处理,而中长期储存可保存在10至100 mM NaOH溶液中。


特点

  • 工业化规模的复合模式阳离子树脂填料,可再高盐条件下对目标蛋白的捕获和杂质的去除。
  • 优越的分离性能、典型的混合模式树脂,拥有与传统的离子填料和疏水填料不能比拟的独特的选择性
  • 能够在低或高电导率下分离具有相似等电点和/或疏水性的蛋白质
  • 多次重复纯化循环后,仍具有较高动态结合能力
  • 回收率高,洗脱体积小
  • 易再生
  • 独特设计用于捕获具有挑战样本中的单克隆抗体(mab)、Fab抗体片段和重组蛋白


CMM HyperCel树脂的主要特性

粒径范围

50-80 μm

配体说明氨基苯甲酸
配体密度

Av. 70 μeq/mL

动态结合能力
BSA1pH 4.5下> 50 mg/mL, 15 mS/cm
IgG2pH 4.0-5.0下> 60-100 mg/mL, 4-12 mS/cm
工作条件
结合pH ~ 4 to 6; 电导率高达50 mS/cm3
洗脱pH ~ 4 to 9; 电导率高达50 mS/cm3
1,000 cm/hr时的工作压力4

~ 1.0 bar g

工作pH2至13
清洗pH

1 至 14

在位清洗1 M NaOH - 1 小时接触时间 - 5 CV
1 含有4 g/L BSA的50 mM NaCl的醋酸钠溶液,保留时间7分钟
2 含有5 g/L BSA的50 mM NaCl的醋酸钠溶液,保留时间2分钟
3 用NaCl调解电导率( 0 -0.5 M)
4 采用50 mM醋酸钠溶液(pH 5.0)、15 mm内径 x 200 mm长的实验室用层析柱测定

高选择性,分离具有相似等电点和/或疏水性的蛋白质

可从碱性蛋白质(如单克隆抗体)分离出酸性蛋白(如卵清蛋白)以及从亲水性蛋白质(如乳球蛋白)分离出疏水性蛋白质(如单克隆抗体),说明CMM HyperCel树脂对广范的生物分子具有良好的选择性。


对蛋白有较强的结合能力

混合模式树脂可以解决离子交换剂无法解决的纯化难题,而这也通常是以降低结合载量为代价。然而,与其他层析技术相比,CMM-HyperCel树脂表现出良好的结合性能。

在两种不同的电导率下测试了两种分子(BSA,MAb)的动态结合载量(DBC)。在这两种情况下,DBC均高于60 mg/mL,并且MAb即使在15 mS/cm下仍保持较高水平,这有利于工艺整合,而无需在负载前进行缓冲液交换或稀释。结合和洗脱的pH与维持单克隆抗体稳定性是保持一致的。


有效再生可维持较长的使用寿命

为了测试再生效率,从澄清的CHO细胞培养上清液中纯化单克隆抗体,进行了五个完整的纯化循环。每次洗脱后,用1N NaOH(1小时接触时间)再生色谱层析树脂,并测试了10%穿透时的DBC。DBC保持不变,确认了树脂的有效清洁。 

CMM HyperCel树脂

类型

货号

CMM HyperCel, 25 mL

20270-025

CMM HyperCel, 100 mL

20270-031

CMM HyperCel, 1 L

20270-041

CMM HyperCel, 5 L

20270-055

CMM HyperCel, 10 L

20270-066

 层析柱

类型

货号

PRC预装柱 5x50 CMM HyperCel, 1 mL

PRCCMMHCEL1ML

PRC预装柱 8x100 CMM HyperCel, 5 mL

PRCCMMHCEL5ML

Robo柱 * CMM HyperCel 200 μL, 第8行

SR2CMM

Robo柱 * CMM HyperCel 600 μL, 第8行

SR6CMM

*RoboColumn是Repligen的一个商标。

CMM HyperCel 混合模式树脂

PDF | 1.4 MB

MEP Hypercel- 巯基乙基吡啶

MEP Hypercel为单克隆抗体的捕获或精纯提供了独特的选择性。,可除去聚集体、HCP和DNA。配体有利于在适度盐浓度和中性pH下目标蛋白的结合。 

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引言

MEP-HyperCel混合模式层析树脂用于从实验室到生产规模的各种抗体和重组蛋白的捕获和纯化。它具有:

  • 蛋白质分离的独特分离机制和选择性 
  • 无盐/低盐条件下的疏水层析法(HIC)
  • 克隆和多克隆IgG捕获和中间纯化(聚集体、DNA和HCP去除)
  • 增强工艺经济性


MEP-HyperCel树脂具有一种不同于传统的离子交换或亲和机制的特殊混合模式或多模式分离机制,可以替代传统的疏水层析捕获疏水分子。MEP HyperCel树脂在工艺规模上使用时具有显著的优点;特别是与传统HIC相比,MEP HyperCel树脂不需要添加大量的盐来促进蛋白质结合,从而简化工艺操作,减少单元操作(例如透滤或超滤),获得更好的工艺经济性。由于其配体结构,MEP-HyperCel树脂具有免疫球蛋白选择性。它可结合其他常规方法(如阳离子交换、HIC),用于从各种原料中直接捕获IgG或中间纯化IgG,甚至可用于在蛋白质A亲和捕获后增强DNA清除、HCP(宿主细胞蛋白质)和聚集体去除。


对于“非抗体类”蛋白质(例如,重组蛋白质、酶等),MEP-HyperCel树脂也可用于纯化过程中的捕获或中间步骤。在捕获步骤中使用时,通常直接上样,无需调整pH值或离子强度。


MEP HyperCel树脂有利于简化工艺开发,减少透滤或超滤等单元操作,并减少废弃物处理;MEP HyperCel树脂具有较长的使用寿命,因为其能够耐受苛刻的在位清洗(0.5至1 M NaOH,30到60分钟的接触时间)- 这些因素都有助于降低纯化成本。 


特点和优势

独特的分离机制和差异选择性

混合模式机制能够实现离子交换或传统HIC等传统技术难以实现的抗体或其他蛋白质的纯化;例如,利用疏水性的差异,以及分离等电点非常接近的蛋白质。


直接从各种原料中捕获免疫球蛋白

由于其独特的配体结构,MEP-HyperCel树脂对免疫球蛋白具有选择性。在中性pH下,与抗体结合,很大程度上与离子强度无关。无需稀释样品的浓度(例如即使原料稀释至50到100μg IgG/mL,也可实现有效捕获)。有关于从无蛋白和补充蛋白的细胞培养上清液、转基因乳、腹水和血清中纯化免疫球蛋白的报道。与蛋白A亲和树脂相比,MEP-HyperCel树脂上的IgG结合能力基本上与亚类或种族无关。“弱结合”变体(例如小鼠IgG1或大鼠IgG)能够很好地保留。MEP-HyperCel树脂有助于HCP的去除和病毒的清除,也提供了一个非常有效的一步从细胞培养上清液中清除DNA的方法。注意,不建议在原料或缓冲液中添加吐温和Triton,因为此类表面活性剂可能干扰蛋白质与MEP HyperCel树脂的结合。


温和条件下IgG的洗脱和杂质的分离

IgG通常在pH 5.5-4.0范围内洗脱,取决于等电点和杂质的情况。与蛋白A亲和相比,这种更温和的洗脱条件有助于减少聚集体形成,能更好地保持抗体的生物活性。此外,MEP HyperCel树脂与pH相关的洗脱机制可基于疏水性的差异将HCP、DNA、抗体聚集体和错折叠从单体IgG中分离。在某些情况下,在MEP HyperCel洗脱缓冲液(0.1至1.0 M)中添加精氨酸可降低抗体聚集的风险,防止许多抗体在酸性pH条件下发生溶解度损失,并可在更温和的pH条件下进行洗脱(pH 7.0左右)。  


无盐/低盐条件下的蛋白结合

几种“非抗体类”重组蛋白已经使用MEP-HyperCel树脂得到纯化。与传统的HIC(例如苯基或丁基配体)不同,蛋白质与该树脂结合不需要添加大量盐,例如硫酸铵或其他感胶离子。这将降低工艺成本和废弃物处理的效益。产品可以在稀释缓冲液中回收,并可最大化地减少单元操作步骤(如超滤或透滤),有利于实现更好的工艺流程和提高工艺的经济性。

方法筛选和放大

MEP HyperCel树脂的物理和化学性质非常适合实验室、中试和工艺规模的使用。MEP HyperCel树脂与通常用于低压或中压的工艺层析系统兼容。对于具有挑战性的蛋白质和杂质的分离,建议筛选MEP-HyperCel树脂以及HEA-HyperCel和PPA-HyperCel混合模式树脂,它们带有脂肪族和芳香族合成配体,可提供多种的层析填料的选择。 


用于实验室规模或方法开发

96孔板或PRC预装柱可实现对目标蛋白的有效分离。1 mL和5 mL PRC预装柱显示出了较高的填充效果(>2500板/米),可直接连接到常用的实验室层析系统,具有最佳的、稳定的性能。通过将树脂填充在实验室空玻璃管柱中,可实现进一步放大(树脂体积可达900 mL)。  


中试和工艺规模应用

MEP-HyperCel树脂可满足蛋白质纯化中试至生产规模的要求,目前已经用于几升到几百升容量的层析柱中。可提供大型柱填充的具体填充方案和技术支持。此外,可提供一个全面的验证包和监管支持文件(RSF),用于协助用户开发验证程序。


对于生产规模,Sartorius提供28 cm至2 m直径的Resolute®层析柱。  

MEP HyperCel树脂由专有的刚性纤维素基质组成,并与4-巯基乙基吡啶(4-MEP)连接。纤维素微珠具有高孔隙率、化学稳定性和低非特异性相互作用。平均粒径为80至100μm,在低柱反向压力下具有优异的流速性能,与大规模生产兼容。MEP HyperCel树脂可用于从实验室规模到上百升生产规模的层析柱。该树脂有多种包装规格可满足用于树脂筛选、快速方法优化的1 mL和5 mL PRC预装柱和放大生产。MEP HyperCel树脂保存于含有20%乙醇的1 M NaCl中,也可根据要求定制包装。  


表1

MEP HyperCel树脂的主要特性

(平均)粒径

80 - 100 µm

hu IgG*的动态结合载量(10%穿透)

> 20 mg/mL

配体4-巯基乙基吡啶
配体密度

80-125 µmol/mL

工作pH(长期)2 - 12 
清洗pH(少于6小时)2 - 14 
耐压性

< 3 barg (44 psig)

工作压力

< 1 barg (14 psig)


采用5 mg/mL人IgG的PBS缓冲液、6分钟保留时间(流速70 cm/h)测定

应用示例

应用1-从“富含蛋白质”的原料中纯化大鼠IgG:通过pH值逐步降低的步骤进行洗脱条件优化

选择了富含蛋白质的原料(胎牛血清含量为15%的大鼠IgG)来说明洗脱pH值对抗体纯度的影响。在第一系列实验中,IgG片段在pH 4.0下洗脱;然而,大量的杂质也在pH 4.0下洗脱,包括脱落的自由轻链(TFLC),导致目标IgG的纯度中等(约75%)。然后,在pH 5.5、5.2、4.6、4.0和3.0下进行pH梯度洗脱。使用pH5.5洗脱,IgG洗脱纯度提高到95%(该部分含有4%的TFLC,并且明显不含其他杂质[通道 4])。当pH值降至5.2时,显示TFLC的解吸,其浓度增加(通道5)。

当pH值降至4.6,然后再降至pH 4.0(通道6和7)时,杂质成分被洗脱出。最后,TFLC在pH3.0(通道8)下被洗脱出。 基于这些发现,目标抗体的最佳洗脱应在pH5.5下进行。


数据由弗吉尼亚联邦大学的J. Ford和D. Conrad提供。


应用2-实验室规模的从腹水中纯化单克隆IgG 

MEP-HyperCel树脂被用于纯化腹水中IgG。为了降低粘度,把用同样体积的平衡缓冲液稀释后的样本装入层析
柱中。根据层析图,IgG纯度为83%,收率为79%。在DEAE陶瓷HyperD®F树脂上进行阴离子交换层析可提高IgG组分的纯度。


应用3-从“富含蛋白质”(含白蛋白)的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞培养上清液(CCS)中一步捕获小鼠单克隆IgG1 

MEP-HyperCel树脂在一步纯化IgG时,可达到与蛋白A树脂层析相同水平的纯度和产率,即使CCS含有大量白蛋白作为主要杂质。 


应用4-用MEP HyperCel树脂在MAb捕获步骤中去除CHO细胞培养液中的杂质(HCP和DNA)

MEP-HyperCel树脂被用于捕获无蛋白CHO细胞培养上清液中的MAb。结果(下表3)表明DNA去除非常有效(>4.7 Log),HCP降低了100倍。接着使用CM Ceramic HyperD®​ F阳离子交换树脂对样品进行下一步纯化,HCP的含量得到进一步的降低(未显示数据)。


应用5-MEP HyperCel树脂作为HIC替代品用于纯化大肠杆菌重组蛋白的评估:工艺效益总结

在大肠杆菌重组蛋白纯化流程中,使用MEP-HyperCel树脂替代Butyl填料进行纯化。结果(下表4)表明,在该工艺的第2步或第3步使用MEP HyperCel树脂可降低蛋白质结合所需的盐,具有更高的载量和纯度,且不需要传统工艺中比较费时的分子尺寸排阻步骤。


表3CHO细胞培养液中杂质的去除

组分IgG回收率(%)

IgG (ng/mL)

HCP (ppm)

HCP (降低Log10)

HCP (ng/mL)

DNA (ppm)

DNA (降低Log10)
初始物料

100

92000

102000

-

705

781

-

MEP HyperCel 树脂纯化后样品

93

8600

1200

1.9

<0.1

<0.014

>4.7

DNA分析使用Quant-IT♦ PicoGreen♦ dsDNA 试剂盒 (Invitrogen); HCP分析使用ELISA试剂盒 (Cygnus Technologies)。


表4使用MEP HyperCel树脂替代疏水层析(替代丁基配体)纯化大肠杆菌重组蛋白

常规工艺HIC(丁基)层析步骤替代HIC层析的MEP HyperCel树脂层析工艺步骤
工艺过程中层析步骤数量4(含最终尺寸排阻)3(不含最终尺寸排阻)
蛋白质结合所需的盐浓度

3.5 M NaCl

2 M NaCl

结合载量

良好(比HIC传统树脂高10倍以上)

稳健性

不适用出色(11次发酵)
纯度(C4 HPLC 分析)需要HIC层析步骤后分子排阻


HIC =疏水层析
SEC = 尺寸排阻层析
描述

尺寸

货号

MEP HyperCel

25 mL

12035-010

MEP HyperCel

100 mL

12035-028

MEP HyperCel

1 L

12035-036

MEP HyperCel

5 L

12035-040

MEP HyperCel

10 L

12035-044

PRC柱 5x50 MEP HyperCel预装1 mL吸附剂

PRC05X050MEPHCEL

PRC预装柱 8x100预装5 mL吸附剂

PRC08X100MEPHCEL


类型

货号

Robo柱 MEP HyperCel 200 μL, 8排

SR2MEP

Robo柱 MEP HyperCel 600 μL, 8排

SR6MEP


MEP HyperCel复合模式层析树脂 - 疏水电荷诱导层析 | HCIC

PDF | 701.0 KB

HEA Hypercel – 己胺

HEA-Hypercel是一种含有一条弱疏水性的己胺链的复合型配基,在中性pH及适度盐浓度下可与蛋白质结合。 

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HEA和PPA HyperCel树脂是一种可扩展至工业级的层析树脂,用于在生物制药环境中捕获蛋白质和去除杂质。在“混合模式”机制下,它们作用是基于蛋白质与配体的静电作用和疏水作用的结合。

HEA和PPA HyperCel树脂拥有与传统的离子填料和疏水填料不能比拟的独特选择性,可用于工艺过程的开发。

例如,可以利用混合模式作用机制来实现蛋白质异构体分离或具有相似或非常接近的等电点的蛋白质的分离,而传统的方法通常很难实现。从实验室到生产规模的层析柱,树脂的机械稳定性使其能够在高流速下使用。

使用复合模式树脂的优势:

  • 可在低离子强度下直接通过疏水层析模式捕获蛋白
  • 通过新配基的选择性分离具有挑战性的混合物
  • 可与离子层析或其他层析步骤交替使用

HEA和PPA HyperCel树脂是Sartorius混合模式层析树脂家族的成员,与MEP HyperCel树脂(疏水电荷诱导)相辅相成。HEA和PPA HyperCel树脂携带合成配基,目前用于500升的大型柱体积的固定化树脂生产,HyperCel树脂是一种机械性能稳定的基质,已用于> 100升柱体积蛋白质的生产。配基包括脂肪族(HEA-己胺胺)和芳香族(PPA-苯基丙胺)胺,它们具有不同的选择性和疏水能力。


粒径

80-100 µm (avg)

颗粒组成高孔隙率交联纤维素
BSA的动态结合载量(10%穿透)

40-60 mg/mL

配基:脂肪族(HEA)己胺 

芳香族(PPA)

己胺苯丙胺 
BSA回收率

>90%

工作pH

2 - 12

清洗pH

1 – 14

耐压性

< 3 bar (44 psi)

典型工作压力

< 1 bar (14 psi)


¹测定溶液:含5mg/mL BSA的PBS,流速:100 cm/h


操作原理和一般指导原则

(有关柱填充、缓冲液和建议的详细信息,请参阅产品说明书。)


蛋白质结合

蛋白质通常在中性pH值(即PBS,pH7.4)下,通过疏水作用发生结合。结合碱性较强的蛋白质需要提高pH值(通常pH 9.0)。

在推荐的结合盐浓度下,离子交换结合可能受到限制。不同于传统的HIC,在“接近类似生理的环境”的低离子强度条件下结合蛋白。一般来说,不需要添加感胶离子盐或其他盐;但在某些情况下,添加适量的盐(例如0.5 M硫酸铵)可促进蛋白质吸附。

PPA-HyperCel树脂带有芳香族配基,其疏水性比HEA-HyperCel树脂更强。结合能力是蛋白质的一种功能。对于BSA等蛋白质模型,HEA和PPA HyperCel树脂的典型结合载量为40至60 mg/mL(含0.14 M NaCl的PBS缓冲液,pH 7.4,流速100 cm/h)。影响结合载量的因素包括温度、保留时间、等电点、目标蛋白的疏水性和柱效。(建议使用PRC预装柱进行筛选)。


蛋白质洗脱

随着pH值降至低于蛋白质的pI和配体的pKa时,蛋白质由于电荷的排斥作用被洗脱下来。通过降低pH值(从7到2)进行洗脱,因为一些蛋白质可以在不改变pH值的情况下通过降低盐浓度来洗脱。在实验室规模上,可以通过盐梯度洗脱实验来实现优化;而在工艺规模上一般选择分段洗脱模式。这种方法可从疏水性不同的杂质中分离出目标蛋白。碱性蛋白质较早从pH梯度或分段洗脱过程中解吸下来,随后是较多的酸性蛋白被洗脱下来。

与传统的HIC不同,目标蛋白在稀释缓冲液中进行回收,省去中间超滤过程,减少了单元操作,有利于提高工艺经济性。


尺寸

HEA HyperCel

货号

25 mL

20250-026

100 mL

20250-033

1 L

20250-041

5 L

20250-042

10 L

20250-056

1 mL PRC预装柱, 5 mm ID x 50 mm

PRC05X050HEAHCEL

5 mL PRC预装柱, 8 mm ID x 100 mm

PRC08X100HEAHCEL

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类型

货号

Robo柱 HEA HyperCel 200 μL,8排

SR2HEA

Robo柱 PPA HyperCel 200 μL, 8排

SR2PPA

Robo柱 HEA HyperCel 600 μL, 8排

SR6HEA

Robo柱 PPA HyperCel 600 μL, 8排

SR6PPA

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HEA和PPA HyperCel树脂复合模式层析用于蛋白质分离 

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PPA Hypercel - 苯丙胺

与HEA-Hypercel相比,PPA-Hypercel表现出更强的疏水性,这为蛋白质纯化中提供了不同的选择性。 

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HEA和PPA HyperCel树脂是一种可扩展至工业级的层析树脂,用于在生物制药环境中捕获蛋白质和去除杂质。在“混合模式”机制下,它们作用是基于蛋白质与配体的静电作用和疏水作用的结合。

HEA和PPA HyperCel树脂拥有与传统的离子填料和疏水填料不能比拟的独特选择性,可用于工艺过程的开发。

例如,可以利用混合模式作用机制来实现蛋白质异构体分离或具有相似或非常接近的等电点的蛋白质的分离,而传统的方法通常很难实现。从实验室到生产规模的层析柱,树脂的机械稳定性使其能够在高流速下使用(压力和流速数据见图2)。

使用复合模式树脂的优势:

  • 可在低离子强度下直接通过疏水层析模式捕获蛋白
  • 通过新配基的选择性分离具有挑战性的混合物
  • 可与离子层析或其他层析步骤交替使用

HEA和PPA HyperCel树脂是Sartorius混合模式层析树脂家族的成员,与MEP HyperCel树脂(疏水电荷诱导)相辅相成。HEA和PPA HyperCel树脂携带合成配基,目前用于500升的大型柱体积的固定化树脂生产,HyperCel树脂是一种机械性能稳定的基质,已用于> 100升柱体积蛋白质的生产。配基包括脂肪族(HEA-己胺胺)和芳香族(PPA-苯基丙胺)胺,它们具有不同的选择性和疏水能力。


粒径

80-100 µm (avg)

颗粒组成高孔隙率交联纤维素
BSA的动态结合能力(10%穿透)

40-60 mg/mL

配体:脂肪族(HEA)己胺

芳香族(PPA)

己胺 苯丙胺
BSA回收率

>90%

工作pH

2 - 12

清洗pH

1 – 14

耐压性

< 3 bar (44 psi)

工作压力

< 1 bar (14 psi)


¹测定溶液:含5mg/mL BSA的PBS,流速:100 cm/h



操作原理和一般指导原则


蛋白质结合

蛋白质通常在中性pH值(即PBS,pH7.4)下,通过疏水作用发生结合。结合碱性较强的蛋白质需要提高pH值(通常pH 9.0)。

在推荐的结合盐浓度下,离子交换结合可能受到限制。不同于传统的HIC,在“接近类似生理的环境”的低离子强度条件下结合蛋白。一般来说,不需要添加感胶离子盐或其他盐;但在某些情况下,添加适量的盐(例如0.5 M硫酸铵)可促进蛋白质吸附。

PPA-HyperCel树脂带有芳香族配基,其疏水性比HEA-HyperCel树脂更强。结合能力是蛋白质的一种功能。对于BSA等蛋白质模型,HEA和PPA HyperCel树脂的典型结合载量为40至60 mg/mL(含0.14 M NaCl的PBS缓冲液,pH 7.4,流速100 cm/h)。影响结合载量的因素包括温度、保留时间、等电点、目标蛋白的疏水性和柱效。(建议使用PRC预装柱进行筛选)。


蛋白质洗脱

随着pH值降至低于蛋白质的pI和配体的pKa时,蛋白质由于电荷的排斥作用被洗脱下来。通过降低pH值(从7到2)进行洗脱,因为一些蛋白质可以在不改变pH值的情况下通过降低盐浓度来洗脱。在实验室规模上,可以通过盐梯度洗脱实验来实现优化;而在工艺规模上一般选择分段洗脱模式。这种方法可从疏水性不同的杂质中分离出目标蛋白。碱性蛋白质较早从pH梯度或分段洗脱过程中解吸下来,随后是较多的酸性蛋白被洗脱下来。

与传统的HIC不同,目标蛋白在稀释缓冲液中进行回收,省去中间超滤过程,减少了单元操作,有利于提高工艺经济性。

尺寸

货号

25 mL

20260-025

100 mL

20260-030

1 L

20260-040

5 L

20260-045

10 L

20260-052

1 mL PRC预装柱, 5 mm ID x 50 mm

PRC05X050PPAHCEL

5 mL PRC预装柱, 8 mm ID x 100 mm

PRC8X100PPAHCEL

索取报价


货号

类型

SR2HEA

Robo柱 HEA HyperCel 200 μL,8排

SR2PPA

Robo柱 PPA HyperCel 200 μL, 8排

SR6HEA

Robo柱 HEA HyperCel 600 μL, 8排

SR6PPA

Robo柱 PPA HyperCel 600 μL, 8排

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HEA和PPA HyperCel树脂复合模式层析用于蛋白质分离 

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