多篇优秀的应用Octet^® 测小分子文章发表

Octet^® 非标记分子互作系统采用的生物层干涉技术（BLI）是写入美国药典的互作技术，相关应用文章已经达到了13,000多篇。

目前，每天平均有3篇应用Octet^® 的文章发表，而其中就平均有1篇是测小分子的。仅仅在过去几个月，就有多篇的优秀的Octet^® 小分子文章发表。下面，就让我们一起来看看其中的几篇代表：

农药测定

中国农业科学院植物保护研究所^[1]

基因突变是植物在除草剂选择压力下的一种基本进化机制。EPSPS合酶的突变对草甘膦的抗性起到了重要作用。本文评估了牛筋草的EPSPS合酶的Pro106Leu（P106L）、Pro106Ser（P106S）和Thr102Ile + Pro106Ser突变（TIPS）体在生物化学和生理水平上的功能和适应性特征。Octet^® 分子互作显示，天然EPSPS合酶对草甘膦的亲和力是磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP）的53.8倍，TIPS的突变体中增加为87.5倍。P106L、P106S和TIPS突变体比天然EPSPS合酶高2.4倍、0.7倍和4.1倍，分别对应于2.5、1.9和11.4的抗性水平。这揭示了分子水平亲和力与酶活以及抗性之间的关系。

图1. EPSPS合酶与草甘膦的部分亲和力测定Octet^® 原始数据，用SSA传感器固化EPSPS合酶，与6.25-50μM的草甘膦以及400-6400μM的PEP进行结合解离。

表1. 分析后的动力学参数（Kon, Koff, KD）结果。

小分子药物筛选

中国医科大学盛京医院^[2]

醛脱氢酶1（ALDH1）是乳腺癌症干细胞的标志物（BCSC），其酶活性调节肿瘤干性。识别控制ALDH+细胞的上游靶点可能抑制三阴性乳腺癌症TNBC肿瘤。本文发现KK-LC-1细胞通过与FAT1结合并随后促进其泛素化决定了TNBC ALDH+的干性。采用计算和Octet^® 互作筛选的方法，发现Z8398787730（Z8）作为一个小分子可以结合KK-LC-1，通过激活Hippo途径机制抑制TNBC肿瘤生长，并降低TNBC ALDH+细胞的干性和活力。这些发现确定了抑制ALDH+细胞中的KK-LC-1-FAT1-Hippo-ALDH1A1通路作为TNBC的潜在治疗手段。

图2. (A) 用Octet^® 单浓度筛选KK-LC-1抑制剂（145个）；(B) 用Octet^® 进行Z8的多浓度亲和力测定，亲和力为4.3μM；(C) Z8的分子结构

Octet^® +Incucyte^® 联用

德国马克斯普朗克分子生理研究所^[3]

RNA结合和调节蛋白LIN28的小分子抑制剂是治疗癌症的候选药物。之前报道的破坏了LIN28和let-7 miRNA相互作用的小分子只显示了中度到弱的抑制活性。本文LIN28抑制剂设计基于螺环化设计和铬吡唑支架。代表性化合物显示了对LIN28–let-7相互作用的有效的体外抑制活性，对LIN28阳性的JAR癌症细胞的IC50达到μM级别。

图3. （左）使用Octet^® 检测固化在SA传感器上的LIN28和小分子的结合；（右）使用Incucyte^® 实时活细胞分析系统监测化合物对肿瘤细胞的抑制作用

海量小分子亲和力数据

密歇根大学王少萌组^[4]

BET蛋白属于溴结构域相关蛋白家族，其成员包括BRD2，BRD3，BRD4和BRDT。BET蛋白被认为是治疗疾病的潜在有效靶点，已被开发为治疗NUT中线癌（NMC）、小细胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌。BET蛋白是高度同源的蛋白，尽管BET蛋白具有一些重叠的功能，但每个BET蛋白在基因调控、生物过程和人类疾病中都有其特定的作用。基于非选择性的BET抑制剂QCA276，作者使用精确的构象控制方法开发了两种强效和高选择性的BRD4降解剂BD-7148和BD-9136。这些化合物在低至1 nM的浓度下诱导细胞中BRD4蛋白的快速降解。本文用Octet^® 评估了这些抑制剂与BET蛋白家族的亲和力。

图4. Octet^® 部分数据：小分子抑制剂与不同BET蛋白家族的亲和力均达到nM级别的KD值；用SSA传感器固化BET蛋白家族，与小分子进行结合解离

Octet^® 提供多种传感器固化蛋白，固化方式可以根据蛋白所带的标签决定，组氨酸融合标签可以用NTA传感器或者已经固化了组氨酸标签抗体的传感器；如果蛋白带有生物素标签，可以用链霉亲和素传感器。一般来说，为了克服空间位阻和获得比较高的固化密度，建议选择链霉亲和素传感器固化蛋白。分析物的分子量检测下限约为150Da, 也有成功检测了分子量98Da的化合物的应用案例，并且获得了可观的信号（>0.1nm）[5]。

Octet^® 所依赖的生物层干涉（BLI）技术可以实现对相互作用更加定量化地测定，非常适合亲和力比较低的化合物检测。在传统的方法中，化合物解离快、有洗涤等步骤，使得结合的小分子被洗掉后易产生假阴性结果；另外传统方法多数需要标记，可能会改变靶点分子的构象，也会产生假阳性结果。SPR技术容易受到溶剂效应影响，也不适合一些溶解性差的小分子。对比之下，Octet^® 的非标记和实时检测可以克服传统方法的弊端，使得小分子相互作用检测结果更加真实可靠！

Octet^® 做小分子太受欢迎了，但是身处小分子实验室的您是否有以下疑问：

• 做各类小分子互作，如何选择最合适的传感器？
• 小分子动力学分析为何首选超级链霉亲和素（SSA）生物传感器？与链霉亲和素（SA）生物传感器的区别是什么？
• 固化浓度多高合适？如何优化？
• 什么是双扣除？双扣除一定要做吗？
• 超级链霉亲和素（SSA）生物传感器如何再生？

《生物层干涉技术应用文集第三版》全新改版！

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-参考文献-

[1] Potential Role of EPSPS Mutations in the Resistance of Eleusine indica to Glyphosate. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 8250.

[2] KK-LC-1 as a therapeutic target to eliminate ALDH+ stem cells in triple negative breast cancer. Nature Communications | (2023) 14:2602

[3] Spirocyclic Chromenopyrazole Inhibitors Disrupting the Interaction between the RNA-Binding Protein LIN28 and Let-7. : ChemBioChem 2023, e202300168

[4] Precise Conformational Control Yielding Highly Potent and Exceptionally Selective BRD4 Degraders with Strong Antitumor Activity. J. Med. Chem.

[5] Inhibition of fungal pathogenicity by targeting the H2Ssynthesizing enzyme cystathionine β-synthase. Sci. Adv. 8, eadd5366 (2022)