赛多利斯支原体检测试剂盒：支原体污染解决方案
支原体是最小的自由生存生物。它们属于细菌类柔膜细菌目，其特征在于无细胞壁。因此，它们不受许多常用抗菌剂的影响。支原体是细胞培养中广泛存在的污染物。由于支原体非常微小（约 0.3 - 0.8μm），无法用光学显微镜观察到支原体污染，受感染细胞培养物中的生长率和形态的改变会很小且不明显。但是受支原体污染的产品会造成人类健康风险。所有这些都清楚地表明了对支原体常规检测的高需求。
赛多利斯Microsart® ATMP支原体检测试剂盒能够根据《欧洲药典》2.6.7可靠、灵敏地检测细胞培养中和细胞培养衍生生物制品中的支原体DNA。
在本研究中，通过使用赛多利斯的定量CFU和GC标准，对9种不同种类支原体基因组拷贝（GC）和菌落数（CFU）之间的相关性进行了研究。由于PCR技术仅检测基因组拷贝（GC），而不同的监管部门，如韩国食品和药品监督管理局（KFDA）和日本药品和医疗器械管理局（PMDA）要求在通过细胞培养产品质量控制所用的检测前要提供菌落数（CFU）与基因组拷贝（GC）的相关性。本研究的结果表明，尽管不同种类支原体间的基因组拷贝数不同，但都成功关联了20 CFU或是40 CFU的比例相关性。
材料和方法
Microsart® 支原体验证标准品的DNA提取
Microsart® 支原体验证标准品的每一包装包含3个小瓶，每个小瓶包含 10 CFU 所选支原体种类。将 250μl 杜氏最低营养必需培养基（DMEM）+10%胎牛血清（FBS）加到两个小瓶中，以制备一份浓度为 40 CFU/ml的悬浮液。将 500 μl DMEM +10%FBS加到一个小瓶中，以制备一份浓度为 20 CFU/ml的悬浮液。根据方案用Microsart® AMP 提取试剂盒平行提取各细胞悬浮液的DNA。洗脱液直接用于Microsart® ATMP 支原体qPCR 试剂盒检测。
Microsart® 校准试剂标准曲线
表1：针对不同种类支原体的Microsart® 支原体验证标准品和Microsart® 校准试剂的产品概述。
为了量化Microsart® 支原体验证标准品的 DNA 提取物，有必要使用已知浓度的基因组拷贝（GC）建立一条标准曲线。因此，使用了Microsart® 校准试剂。校准试剂再水合后含特定细菌10⁶ GC/μl 。在 Tris 缓冲液中制备稀释梯度系列样品，以使最终浓度达到5 GC/10μl 至 500 GC/10μl。
Microsart® ATMP 支原体qPCR 试剂盒
对试剂盒里所有冻干组分再水化。针对一次反应，将 15μl 的支原体混合物与 1μl 的内标对照 DNA 混合。将 15μl 该混合物加至每个 PCR 管中。每次至少使用两个无模板对照（NTC）进行检测，并且平行取样两份。因此，将 10μl 的样本或 NTC 分别加至带有反应混合物的 PCR 管中。
在荧光定量 PCR 仪 CFX96 Touch Cycler（Bio-Rad；45 个周期，3min 95 ℃，30s 95 °，30s 55 ℃，45s 60 ℃）上进行Microsart® ATMP 支原体 qPCR 检测。支原体DNA由一条FAM™ 荧光通道中的增强荧光信号表示。在同一试管中的 ROX™ 通道中检测到内标对照DNA，该试剂盒用 FAM™ 和 ROX™ 双探针来指示 PCR 检测系统的正常无抑制。使用CFX Manager Software（Bio-Rad）进行反应分析。《欧洲药典》/《美国药典》中列出的所有支原体种类的检测限为≤10cfu/ml。
结果
图2和3显示了莱氏衣原体的示例性扩增图。基于ct值（FAM™通道）和标准浓度，CFX Manager软件使用一个线性方程创建了一条标准曲线（图1）。回归系数0.983表明标准曲线良好。最优 qPCR 的效率为100%。在这种情况下，扩增子 DNA 将在每个周期内翻倍。根据对 CFX 软件的分析，莱氏衣原体的示例性 qPCR 运行以101%的效率高效运行（参见图1中的效率）。
图1：使用Microsart® ATMP支原体试剂盒产生的最终基因组拷贝（GC）浓度5 GC/10μl至500 GC/10μl的莱氏无胆甾原体（Microsart® 校准试剂）的示例性标准曲线。
每个样本和无模板对照（NTC）都显示了内标对照DNA的一个扩增，因此也造成了ROX™通道中的荧光信号（Ct<40；数据未示出）。表明了PCR检测成功且无抑制。如预期，NTC在FAM™通道中未显示荧光信号（参见图2和图3）。因此，表明了 PCR 反应的无支原体制备无交叉感染。
图2：Microsart® ATMP支原体qPCR试剂盒生成的莱氏无胆甾原体的示例性扩增图。
图3：Microsart® ATMP支原体qPCR试剂盒生成的莱氏无胆甾原体的示例性扩增图。
已在所有样本中成功检测到20 CFU/ml 和40 CFU/ml 的每种支原体（测定LOD≤10cfu/ml；在试剂盒验证期间确定）。
基于标准曲线的线性方程，软件计算的支原体样本GC浓度（20CFU/ml 和 40CFU/ml 提取物）。9 种不同种类支原体的平均GC/CFU比率如表2所示。
表2： 9种不同种类支原体的平均GC/CFU率
讨论
在本研究中，使用赛多利斯定量 GC 和 CFU 标准研究了 9 种不同种类支原体的基因组拷贝（GC）和菌落数（CFU）之间的相关性。研究结果表明：GC 值高于 CFU 值。理论 GC:CFU 比率应为1:1，因为理想情况下，每个细胞应检测一个GC。实际上，即使在早期指数增生期就收获支原体培养物，以防止在制剂中检测到死细胞DNA，该比率也是不可实现的。出现非等比是因为大量的支原体细胞不会在培养基中生长成菌落并不被检测到（即，活的但非可培养的细胞）。此外，支原体细胞易于形成团聚体，会被检测为1个CFU，但实际上它结合了多个细胞，因此是好几个GC。
这两种情况都会严重低估细胞培养样本中的真实支原体细胞数，因为只有一部分细胞会生长为一个CFU。使用基于生长的方法，不可培养的物种或可生存但不可培养的细胞可能导致假阴性的结果。由于基于生长的方法中的假阴性结果而未检测到支原体污染可能会产生具有潜在感染风险的不安全产品，特别是对于免疫缺陷的患者，这种风险会更严重。
总结
本研究表明：GC 和 CFU 之间的相关性可以成功地被证明，并且在验证期间易于实施证明试验。另外，可以通过 PCR 的 GC 检测显示各样本中实际污染水平的一个更真实结果，因此直接有利于药物安全。
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