利用实时活细胞分析了解巨噬细胞的功能

分化确认。监测永生化 THP-1 细胞和血源性原代单核细胞在分化过程中的形态学变化。 THP-1 细胞暴露于 5 ng/mL PMA 48 小时后分化成 M0 巨噬细胞。原代单核细胞在 50 ng/mL GM-CSF 中培养 6 天后，在 1 ng/mL LPS + 20 ng/mL IFN-γ 中继续培养一天后可分化成类-M1 表型的细胞，或在 50 ng/mL M-CSF 中培养 6 天，然后在 20 ng/mL IL-4 中继续培养一天后分化成类-M2 表型的细胞。注意细胞形态与之前研究中的发现一致 (Young et al, J Immunol, 1990)；M1 细胞群呈现煎蛋形态，M2 细胞群为煎蛋形态和梭形细胞的混合形态。

分化过程跟踪。相位图中显示了人 iPSC-源性单核细胞（0-7 天）分化中的形态。该细胞最终产生分化的人 iPSC-源性巨噬细胞（含有大囊泡）。加入 100 ng/mL M-CSF 以维持培养基至少 7 天，实现细胞分化。

对形态和细胞表面标志物进行可视化处理用于研究细胞分化情况。在CD11b、CD14 或 CD40  复合Incucyte^® Fabfluor-488 抗体存在的情况下，将 THP-1 单核细胞暴露于培养基（未分化）、维生素 D3 或 PMA 中。与培养基单独处理或维生素 D3 处理的细胞相比，PMA 处理后细胞形态显示出明显的变化（高清相差图片）。动态图突出显示了不同处理条件下，细胞表面蛋白表达的差异性和时间依赖性。

单核细胞成熟的生物学意义。将 THP-1 细胞（初始型或 PMA 诱导分化的 M0 细胞）接种到涂覆有纤连蛋白的 ClearView 趋化性膜上。然后，将细胞暴露于 C5a 梯度中，使用 Incucyte^®系统每小时采集一次图像。在 t = 30 h 时进行药理学反应分析。分化后的类巨噬细胞 THP-1 细胞对 C5a 有很强的浓度依赖性反应，分化前 THP-1 对 C5a 产生较弱的反应，或未观察到反应。

巨噬细胞趋化性动态监测的重要性。原代血单核细胞分化为类-M2 表型；培养环境为 50 ng/mL M-CSF 中培养 6 天，然后在 20 ng/mL IL-4 中继续培养一天。巨噬细胞接种到涂覆有 Matrigel 的 ClearView 趋化性膜上，然后暴露于 C5a 梯度中，使用 Incucyte^®系统每 2 小时采集一次图像。进行底部相位分析，并在 4.5 h 和 11 h 时进行药理学反应测定。注意，在较高浓度下，由于响应延迟，C5a 效价发生了显著的时间依赖性变化，这是一种特异性反应，在中性粒细胞中未观察到此类反应。

吞噬作用的定量分析。iPSC 源巨噬细胞 (Axol Bioscience) 以时间和细胞数量依赖性方式吞噬 Incucyte^® pHrodo^® Green E. coli Bioparticles^® 染料偶联物。  每个孔中有 100 μg pHrodo^® Green E. coli Bioparticles^®，iPSC 源巨噬细胞的相差和荧光融合图像显示了随时间的推移 Bioparticles^® 的被细胞摄取的情况。  在每张图像下方是相应的 masked-image，强调使用分割来完全定量吞噬作用动力学。  iPSC 源巨噬细胞使用单一 pHrodo^® Green E. coli Bioparticle（100 μg/孔）获得的吞噬作用时间进程曲线呈现出细胞数量依赖性。

抗-CD47 诱导的 CCRF 细胞吞噬作用。标记的 CCRF-CEM 细胞经浓度递增的抗-CD47 抗体 (B6H12.2) 处理后，加入到人骨髓源巨噬细胞中（BMDM；数值表示为平均值 ± SEM，n = 4）。

巨噬细胞内细胞的成像和定量。J774.A1 巨噬细胞内吞噬的 Jurkat 细胞显示出高荧光强度，与细胞吞噬量成比例。以 2 分钟为间隔快速成像可制作个体吞噬事件的视频。

分化决定吞噬能力。THP-1 细胞暴露于 200 nM PMA 24 小时、暴露于 200 nM PMA 中 24 小时 + 20 ng/mL IFNγ + 1 µg/mL LPS，或暴露于 200 nM PMA 中 24 小时 + 20 ng/mL IL-4，分别分化为 M0、M1 或 M2 巨噬细胞。然后，将细胞与 pHrodo Red 标记的凋亡 Jurkat 细胞共培养，利用被吞噬的 Jurkat 细胞的荧光信号评价分化的巨噬细胞的吞噬能力。数据显示，分化为 M0 和 M2 的 THP-1 细胞有显著更高的吞噬能力，该结果与 M2 巨噬细胞的抗炎功能一致。