使用 Incucyte^® 和 iQue^® 定量分析动态 T 细胞功能

利用 Incucyte^® 免疫细胞杀伤实验可视化免疫细胞/肿瘤细胞的相互作用。(1) 细胞毒性 T 细胞（较小）和标记的肿瘤细胞（较大，红色）之间的物理接触。T 淋巴细胞分裂。(2) 肿瘤细胞被细胞毒性 T 淋巴细胞攻击：“死亡之吻”。(3) 肿瘤细胞形成胞质颗粒，半胱天冬酶 3/7 标记（绿色），核固缩，细胞死亡。(4) 肿瘤细胞有丝分裂：一个细胞分裂为两个。

使用 Incucyte^® 免疫细胞杀伤试验实时检测肿瘤细胞的死亡和增殖（可选）。Incucyte^® 软件易于操作，可直接根据图像检测凋亡的肿瘤细胞（绿色无题，黄色轮廓），实时对活肿瘤细胞计数（Incucyte^® NucLight 红色染料标记的细胞核，蓝色轮廓）。动力学读数显示治疗效果呈时间依赖性。

靶细胞和细胞因子时间进程分析。用 PMBCS 去除 SKOV-3 NucLight 绿色细胞，使用 CD3/CD28 磁珠 (Dynabead) 进行活化。(A) 采用 Incucyte^® 分析的靶细胞计数的时间进程。使用 TCA 试剂盒的 Qbead 组分（Qbeads 或 Assay Builder：IFNγ，选项 1 和 TNFα，选项 2）对仅使用 10 µL/天上清液样品的 (B) IFNγ 和 (C) TNFα 的细胞因子时间进程数据进行定量分析/(D) 根据靶细胞计数 (Incucyte^®) 和细胞因子 (iQue^® 3) 的经时变化绘制的 AUC 浓度响应曲线。

CD3xCD19 BiTE 抗体诱导细胞毒性和靶细胞聚集。Ramos NucLight 绿色细胞与 PBMC 共同接种，使用 BiTE 抗体 (anti-hCD3xCD19) 或对照抗体 (anti-hCD3xβGAL) 激活。在 (A) 对照抗体或 (B) BiTE 抗体的存在下 72 小时的代表性图像。跟踪靶细胞数量 (C) 和聚集 (E) 的 Incucyte^® 时间进程数据（每 3 小时采集一次图像）。采用包括亮度和大小的绿色累积强度度量 (GCU × μm²) 的折射率变化来定量靶细胞。与对照抗体相比，BiTE 抗体存在时靶细胞杀伤 (D) 和聚集 (F) 的 72 小时浓度响应曲线。

活化的 PBMC 对肿瘤球增殖的影响。将稳定表达核限制性 RFP 的 A549 肿瘤细胞接种在一个圆底 ULA 96 孔板中，培养 3 天，待其形成肿瘤球。肿瘤球形成后，在含或不含 Anti-CD3 和 IL-2 抗体混合物的条件下，与新分离的 PBMC 进行共培养。Incucyte^® HD 相位图和荧光图像显示了 PBMC 在不含抗-CD3 和 IL-2 抗体（未活化，上图）和含抗-CD3 和 IL-2 抗体（已活化，下图）的情况下对肿瘤球增殖的影响对比。注意到，活化的 PBMC 存在时，肿瘤球的荧光强度明显减弱。时程图显示了肿瘤球的细胞毒性（根据荧光强度随时间的损失来定量）。数据收集时间为 7 天，每间隔 6 小时采集一次图像。每个数据点代表平均值 ± SEM，n = 3 孔。

白细胞渗出的可视化处理。将 CD3/CD28 Dynabead 活化的原代 T 细胞接种到单层 HUVEC 细胞（由纤连蛋白培养）上，使用 Incucyte^® 系统每分钟采集一次图像。黄色和橙色箭头表示白细胞在 HUVEC 细胞之间移动，最终沿着 ClearView 插入物的孔隙（蓝色圆圈）移动。

原代 T 细胞向 CXCL12 外渗。将 CD3/CD28 Dynabead 活化的原代 T 细胞接种到纤连蛋白培养的 HUVEC 单层膜上。然后，将含 T 细胞的插入物（HUVEC 单层共培养物）在指示浓度下暴露于 CXCL12 梯度中。使用 Incucyte^® ZOOM 每 30 分钟采集一次图像，并进行相位分析。在 t = 6 小时进行药理学反应分析。每个数据点代表平均值 ± SEM，n = 4