用于快速缓冲液置换的渗滤
缓冲液置换是大多数大分子纯化工作流程中一种简单而重要的技术。它可用于去除不需要的物质、调整样品条件或将组分引入样品中。
例如，在离子交换或亲和层析中实现大分子的高效捕获是在特定的缓冲条件下实现的。因此，通常建议在层析前将样品更换为最适合的上样缓冲液。
专业提示： 从澄清的细胞培养物中纯化 His 标记的蛋白质吧！一些培养基配方包括螯合剂，会从亲和层析基质中剥离金属离子。在将样品上样到 Sartobind® Lab IDA 之前，进行缓冲液置换能有效去除这些不需要的物质！
缓冲液置换的常见应用
有三种常用的缓冲液置换方法：透析、凝胶过滤和超滤（表 1）。赛多利斯的缓冲液置换解决方案使用超滤作为首选方法，因为其具有灵活、快速和缓冲液消耗量低的特点。
| 透析 | 凝胶过滤 | 超滤 | |
|---|---|---|---|
| 设备要求 | 低 | 高 | 低-中 |
| 消耗品 | 一次性使用 | 一次性使用或可重复使用 | 一次性使用或可重复使用 |
| 样品通量 | 低 | 低 | 高 |
| 处理速度 | 慢 | 快 | 快 |
| 缓冲液消耗 | 高 | 低-中 | 低 |
表 1：缓冲液置换方法的比较。
- 去除盐和洗涤剂
- 离子强度和 pH 值的调整
- 去除低分子量污染物
- 引入辅因子或抑制剂
- 添加防腐剂
缓冲液置换方法
透析
在这种方法中，将样品放入透析管或包含半透膜的透析容器中。它被交换缓冲液（透析液）包围。由于样品和透析液之间的浓度梯度，缓冲液成分和其他低分子量溶质通过扩散穿过膜（图 1）。
由于透析只需要使用磁力搅拌器和低成本耗材，因此这是一种经济的技术。然而，以扩散为驱动力，这个过程需要很多小时甚至几天才能完成。样品容量通常在 0.1–100 mL 范围内，因此该方法仅适用于研究应用。此外，一次性耗材和大量缓冲液消耗会导致大量浪费。在某些情况下，最终样品体积可能会增加，从而导致大分子稀释并需要浓缩步骤。
图 1：透析是一种经济但耗时的缓冲液置换方法。
凝胶过滤
该技术可在多孔树脂色谱柱上通过尺寸排阻将大分子与原始缓冲液组分分离。样品中的大分子快速通过色谱柱，而原始缓冲液和低分子量溶质通过进入树脂珠的孔而减慢速度（图 2）。
凝胶过滤柱有多种规格，可通过离心力、重力或在 FPLC 系统上进行缓冲液更换。尽管处理方法范围广泛，设备成本可变，但依然可能非常高。处理时间也是变化的，尽管比透析快得多，尤其是使用离心或泵驱动的耗材时。在研究实验室中，这是样品容量最有限的技术，体积范围约为 0.1-10 mL。生物制药生产的规模很有可能需要扩大，但在这里，更大的体积会导致高空间、时间和缓冲液要求。
图 2：凝胶过滤可实现更快的缓冲液更换，但对于体积较大样品的容量有限。
渗滤
该过程涉及将大分子保留在过滤单元内，而缓冲液和低分子量组分则通过半透膜。因此，通过截留物的逐渐稀释和浓缩进行缓冲液交换（图 3）。
与凝胶过滤一样，有多种设计的超滤装置可供选择，可在离心力、气压、溶剂吸收或切向流过滤 （TFF） 下实现快速渗滤。大多数研究实验室通常都有这些所需的设备（离心机、压缩气源或蠕动泵），容量为 0.1–500 mL 及以上，适用于最广泛的工艺体积。
图 3：使用超滤装置，渗滤可实现几乎任何样品体积的快速高效缓冲液置换。
渗滤的优势：
- 高速 - 与传统方法相比，可节省 >90% 的时间
- 更大处理量 — 单步缓冲液置换，样品体积可高达 500 mL。
- 即插即用 - 易于使用的解决方案，对设备的要求最低。
- 减少浪费 — 由于交换量低，可将缓冲液消耗量减少 >98%。
专业提示：您的目标分子是否达到您需要的浓度？大分子可以通过超滤膜保留，同时减少样品体积。尝试使用 Vivaspin® Turbo 或 Vivaflow® ，在缓冲液更换之前或之后快速增加大分子的浓度。
渗滤技术
非连续渗滤
这是一个迭代过程，包括去掉原始缓冲液，然后添加交换缓冲液（反之亦然）（视频 1）。这些步骤重复多次，从而实现高度可控的缓冲液置换。这在评估分子稳定性时特别有用，因为盐浓度或 pH 值等因素可逐渐调整。
视频 1：使用 Vivaspin® 进行不连续渗滤。
连续渗滤
在这种技术中，以与去除原始缓冲液相同的速率将交换缓冲液添加到样品中 （视频 2）。这种单步过程可以提高缓冲液更换的速度和效率，但设置稍微复杂，并且需要特定配件。
视频 2： 使用 Vivaspin® 20 渗滤杯进行连续渗滤。
将超滤与渗滤相结合
超滤也是减少样品体积和浓缩的有用工具。因此，超滤和渗滤都可以按顺序进行，通常可使用相同的超滤装置。这样做的好处是可以减少样品操作和转移步骤的数量，否则可能会降低目标分子的回收率。UF/DF组合是双赢的方式。
精选缓冲液置换资源
常见问题解答
要通过渗滤实现 ≥99% 的缓冲液置换，请使用样品体积的 3–5 倍的置换缓冲液。
为了进行比较，在透析中，通常建议使用样品体积 200–500 倍的交换缓冲液（或透析液）。此外，为了提高该方法的缓冲液置换效率，通常至少更换一次透析液。这会导致大量的缓冲液浪费。
首先选择更高效的缓冲液置换技术，例如渗滤。在开始渗滤（即所谓的超滤/洗滤 （UF/DF） 工艺）之前，选择合适的超滤装置来减少样品体积，可以进一步降低该方法中已经很低的缓冲液消耗量。
使用 Vivaspin® 20 超滤管，最多可向超滤器中添加 2 mL 样品。对于体积不超过 20 mL 的样品，应在渗滤前将其浓缩至 ≤2 mL。
对于较大的样品量，TFF 可以提高工艺效率。Vivaflow® 渗滤储液杯的容量为 500 mL。为了尽量减少缓冲液消耗，我们建议在进行渗滤之前，将大于此体积（最多 5,000 mL）的样品浓缩至 500 mL 或更小。
渗滤比透析等替代方法可节省 >90% 的时间。多样化的超滤装置设计可帮您利用实验室中已有的设备进行渗滤，因此通常不需要对进行额外的设备投资。
此外，与透析袋或凝胶过滤柱相比，超滤装置的容量更高，这意味着可以对整个样品进行缓冲液更换，在大多数情况下，无需预浓缩或以多个较小的等分试样处理样品。
有时会发生膜污染或极化，导致处理时间增加（尽管仍然比透析快得多）。然而，Vivaspin® 和 Vivaflow® 等现代超滤装置的堵塞和极化不太常见，因为它们采用错流的技术和高度优化的流路。
