神经退行性疾病概览

图 1. tau 多肽聚集对神经突长度影响的慢性体外模型。将原代大鼠皮层神经元 (rCortical, Sartorius) 细胞接种到 PDL 96 孔板中（2×10⁴个细胞/孔），在研究期间将其放置在 Incucyte^® 中。接种后 8 天，用 Tau 溶解物或聚集物（肝素比例 4:1，在 37 ℃ 条件下不定时旋转 5 天）处理细胞。对神经突生长进行自动分段和定量。Tau 聚集物造成了神经突长度（80 ± 5 对比 166 ± 3 %，2-3 次重复）出现浓度依赖性降低，非聚集的 Tau，则仅在 150 µg/mL 浓度下对神经突的形成有巨大抑制作用。

图 2.在帕金森病动力学模型中，羟多巴胺 (6-OHDA) 处理后细胞死亡增加同时神经突生长减少。将大鼠原代纹状体和星形胶质细胞的共培养后接种到涂覆有 PDL 的 96 孔板中（密度分别为 2×10⁴ 和 1.5×10⁴个细胞/孔），并使用 Incucyte^® Neurolight-橙色慢病毒试剂 (Sartorius) 进行感染。在含细胞凋亡标志物 Incucyte^® Annexin V绿色染料（0.5%；Sartorius）的培养基中，使用 6-OHDA (2-500 µM) 处理感染 10 天后的培养细胞。使用 Incucyte^® 活细胞分析系统实时获取荧光图像。典型图片显示了用 6-OHDA（19、56 和 167 µM）和溶剂分别处理 21 天后的比较结果。时间进程和药物反应曲线显示，神经突长度（橙色）的浓度依赖性降低，伴随相应的Annexin V 信号（绿色）增强，表明了药物的决定性作用。数据表示为平均值± SEM（3 次重复测定）。

图 3.帕金森病模型中的大脑区域特异性：与皮层区域相比，6-OHDA 可选择性地影响黑质和纹状体神经突生长。将大鼠原代纹状体、黑质或皮层神经元和星形胶质细胞的共培养后接种到涂覆有 PDL 的 96 孔板中（密度分别为2×10⁴ 和 1.5×10⁴个细胞/孔），并使用 Incucyte^® Neurolight橙色慢病毒试剂 (Sartorius) 进行感染。用 6-OHDA (56-500 µM) 处理感染 10 天后的培养细胞。使用 Incucyte^® 活细胞分析系统实时获取荧光图像。柱状图和药物反应曲线显示，药物对不同脑区的神经突长度（橙色）的选择性作用。溶剂数据表明了不同大脑区域神经突形成的差异性发育。数据表示为平均值± SEM（3 次重复测定）。

图 4.功能评估结果表明，尽管 Tau 能够保持神经元的连接，但却诱导了神经元活动的丧失。将大鼠皮层神经元和大鼠星形胶质细胞 (Neuroprime^®, Sartorius) 接种到铺有 PDL 的 96 孔板中（密度分别为2×10⁴ 和 1.5×10⁴个细胞/孔）进行共培养。使用基因编码的钙指示剂 Incucyte^® Neuroburst橙色慢病毒 (Sartorius) 感染神经元，通过测试钙的波动来监测自发的神经元活动。在 Incucyte^® 中，每 24 小时采集一次图像（以 3 帧每秒的速率扫描 3 分钟）。细胞成熟功能性网络形成（14 天）后，使用 AD 相关的肽 tau（聚集体，300 μg/mL）或蛋白磷酸酶抑制剂 OKA (50 nM) 处理细胞。图像显示了在一次完整扫描中的活动范围（最大/最小荧光反应）。钙迹线显示了视野内所有活动对象的钙水平波动。柱状图量化了活动对象的数量（1/图）和关联性（连接性）。这些数据显示，与溶剂相比，tau 处理降低了活动节点的数量（1407 ± 94 对象/图 vs. 920 ± 43 对象/图），其平均强度分别为（13.7 ± 1.7 OCU vs. 7.2 ± 3.6 OCU），但 tau 处理不影响其关联性（0.95 ± 0.01 vs. 0.97 ± 0.01, 2 次重复）。与之相反，OKA 降低了相较于溶剂，减少了活动节点的数量（180 ± 24 对象/图）、平均强度（3.8 ± 0.3 OCU），以及关联性（0.27 ± 0.02, 6 次重复）。数据表示为平均值 ± SEM。

图 5. 2D 和 3D AD患者来源的 iPSC 模型显示出明显的神经突发育和肿瘤球形成。将健康和 AD（PSEN1 突变）来源 iPSC 神经元 (Axol Bioscience) 接种到铺有 ReadySet + SureBond 的 96 孔板（2.5×10⁴ 个细胞/孔 (2D)），或ULA96 孔板中（5×10⁴ 个细胞/孔），然后离心（250 g；10 分钟）。等待 3 天，使细胞形成肿瘤球 (3D)，并依照供应商的方案诱导神经元分化（补充剂 A+B）。2D 研究：使用 Incucyte^® 软件 (Sartorius) 自动定量神经突发育 15 天。时间进程曲线显示，AD患者来源的 iPSC 细胞系的神经突长度比健康对照组更短（分别是 48 ± 3 mm/mm2，80 ± 3 mm/mm2，3 次重复）。3D 肿瘤球生长：使用明场分析以非干扰的方式定量球体大小差异15天。第 6 天在所选孔中加入 Matrigel^® (2.25 mg/mL)，然后对肿瘤球的形态和肿瘤球的发育过程进行 9 天的观察。时间进程曲线显示出两种细胞系肿瘤球大小的明显差异。图像也显示出健康细胞系和阿尔兹海默症细胞系不同过程的发育能力。